Utredning av Makrofag Polarisering Använda benmärg makrofager
Summary
Artikeln beskriver en lätt enkel adaptiv<em> In vitro</em> Modell för att undersöka makrofager polarisering. I närvaro av GM-CSF/M-CSF är hematopoietiska stam / progenitorceller från benmärgen riktad in monocytisk differentiering, följt av M1 eller M2 stimulering. Aktiveringen status kan spåras genom förändringar i cellyteantigener, genuttryck och cell vägar signalering.
Abstract
Artikeln beskriver en lätt enkel adaptiv in vitro modell för att undersöka makrofager polarisering. I närvaro av GM-CSF/M-CSF är hematopoietiska stam / progenitorceller från benmärgen riktad in monocytisk differentiering, följt av M1 eller M2 stimulering. Aktiveringen status kan spåras genom förändringar i cellyteantigener, genuttryck och cell vägar signalering.
Introduction
Distinkt från klassiska inflammatoriska svar, makrofager som infiltrerar vävnad visar ofta polariserad aktivering status som spelar en avgörande roll i regleringen värdvävnad fysiologiska funktioner 1-8. Vid stimulering, kan makrofagaktivering sorteras i classic (M1) och alternativ (M2) aktivering 2, 4, 9. M1 makrofagaktivering beror på Toll-like receptors (TLR) och aktivering av nukleär faktor kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal kinas 1 (JNK1), vilket leder till produktion av inflammatoriska cytokiner, såsom TNF-α och IL- 1β och aktivering av iNOS som resulterar i ökad produktion av reaktiva syrespecies såsom nitrid oxid (NO) 10, 11. Däremot M2 makrofagaktivering rekryterar PPARy, PPARö, eller IL-4-STAT6 vägar, som leder till en alternativ, antiinflammatoriska (M2) aktivering som är associerad med uppreglering av mannosreceptor CD206, och arginas 1 (Arg1) 6, 12 – 14 </ Sup>.
Benmärg härledda makrofager (BMDM) presenterar ett ideal in vitro-modell för att förstå de mekanismer som styr polariseringen av aktiverade makrofager 15. Specifikt kan aktivering av M1 makrofager induceras av lipopolysackarider (LPS) stimulering, medan polarisering av M2 makrofager kan induceras genom IL-4 och / eller IL-13. Äldre benmärg makrofager och aktiverade makrofager kan identifieras genom flödescytometri analys för uttryck av ytantigener, inklusive CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 och CD86 9, 16, 17. Dessutom kan förändringar i cytokinproduktion och cell vägar signalering associerade med makrofag polarisering mätas genom kvantitativ RT-PCR och Western blotting, respektive. Sammanfattningsvis kan musbenmärg härledda makrofager tjäna som en relevant modell för att studera makrofager polarisering in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterar här en enkel och lätt anpassningsbar in vitro förfarande för att inducera aktivering av makrofager härledda från benmärgsstamceller. Detta förfarande kan användas för undersökning av mekanismer som ansvarar för polarisering av makrofager. Renheten av mogna makrofager som erhållits med hjälp av detta protokoll genomsnitt 95-99%, och inga ytterligare reningssteg förfaranden krävs. För att undersöka funktionen av specifika gener av intresse i samband med makrofag polarisering, ekto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av American Heart Association (BGIA 7.850.037 till Dr Beiyan Zhou).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Thermo Scientific | SH30259.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Murine GM-CSF | PeproTech | 315-03 | |
| NH4Cl | StemCell Technologies | 7850 | |
| L-929 | ATCC | CCL-1 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 10 x PBS | Thermo Scientific | AP-9009-10 | |
| Anti-mouse CD11b-APC | eBioscience | 17-0112-81 | |
| Anti-mouse F4/80-FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| Anti-mouse CD69-PE | eBioscience | 12-0691-81 | |
| Anti-mouse CD86-PE | eBioscience | 12-0862-81 | |
| Propidium Iodine | Invitrogen | P3566 |
References
- Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
- Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
- Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -. W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
- Saberi, M., Woods, N. -. B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
- Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -. H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
- Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
- Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
- Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
- Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
- Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
- Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
- Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
