Опишем способ целевой препаратов на центральную нервную систему, или имплантации катетера или при выполнении болюсной инъекции в правый латеральный желудочек у мышей. Мы делаем ставку именно на доставке антисмысловых олигонуклеотидов. Этот метод можно легко адаптировать для других препаратов и крыс.
В связи с невозможностью пересечь гематоэнцефалический барьер, некоторые препараты должны быть доставлены непосредственно в центральную нервную систему (ЦНС). Наши лаборатории особое внимание уделяется антисмысловых олигонуклеотидов (ССО), хотя методы показано на видео здесь также может быть использован для доставки множество других препаратов для ЦНС. Антисмысловые олигонуклеотиды (ССО) имеют возможность нокдаун последовательности конкретных целей 1, а также сдвиг изоформы соотношения специфических генов 2. Чтобы достичь широкого нокдаун гена или сплайсинг в ЦНС мышей, ССО может быть доставлен в мозг с использованием двух отдельных путей введения, оба из которых мы показали в видео.
Первое применение Alzet осмотические насосы, соединенные с катетером, который имплантируется в боковой желудочек. Это позволяет ASOs быть непрерывную инфузию в ЦНС в течение заданного периода времени. Второй включает в себя единичная инъекция из приветGH концентрацию КРМ в правый латеральный желудочек. Оба метода использовать мышь церебральный желудочковой системы для доставки ASO на весь мозг и спинной мозг, хотя в зависимости от потребностей исследования, один способ может быть более предпочтительным, чем другие.
Некоторые наркотики, не могут пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), которым необходим прямой центральной нервной системы (ЦНС) доставки. Чтобы обойти BBB, наркотики могут быть доставлены непосредственно в мозг с использованием описанного метода. В то время как наши лаборатории и бумаги подробные фокус здесь на антисмысловые олигонуклеотиды (ССО), другие препараты, такие как малые молекулы, антитела, векторов генной терапии, и т.д.., Также могут быть доставлены через точно такой же подход.
Некоторые белки играют важную роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. Такие белки часто образуют токсичных видов и накапливаются в агрегаты, что приводит к возможному гибели нейронов и последующего неврологического заболевания 3-4. В попытке замедлить или даже остановить прогрессирование этих заболеваний, один терапевтический вариант может быть нацелены непосредственно и уменьшить причинный белка. Тем не менее, эти белки часто встречаются повсеместно через ЦНС, что затрудняет к электронной ffectively ориентироваться на них в глобальном масштабе.
В целях выявления генов по всей центральной нервной системы, мы управляем ASOs мыши в спинномозговой жидкости (ликвора) через боковой желудочек обойти BBB. Этот конкретный метод принимает преимущество системы мыши желудочка, который омывает весь мозг, спинной мозг, что позволяет широкое распространение ASOs. Мы используем ASOs, которые 18-20 мера РНК-подобные молекулы, которые непосредственно связывать последовательность мРНК-мишени и, в зависимости от модификации ASO химической, либо) набирать РНКазы-H деградировать мРНК приводит к нокдаун или B) сдвиг альтернативного сплайсинга один , 2,16,17. Следует отметить, что несколько молекул существуют для сбивание специфического белка в живом организме, в том числе ShRNA. Так как эти молекулы не являются предметом данной статьи, мы направляем читателя пересмотреть статьи, которые лучше подробно нокдаун механизмы действия и преимущества / недостатки каждого из них 5-6.
jove_content "> В предыдущей работе мы использовали ASOs целевой белок супероксиддисмутазы 1 (SOD1) в трансгенной модели крысы бокового амиотрофического склероза (ALS) +7 (рис. 4). Мутации в СОД1 наблюдается примерно у 2% всех ALS случаев 8, хотя это было недавно предположили, что SOD1 может играть важную роль в спорадических ALS, а 9-10. При уменьшении общей SOD1 уровни у крыс ALS трансгенных, выживание после начала была значительно увеличена 7. Эти важные данные были первыми показать, что лечение ASO в ЦНС может иметь глубокое положительное влияние на неврологическую модель болезни. С тех пор, больным СПИДом, ориентированные на человека СОД1 ввели и успешно завершили Фаза I клинических испытаний человека с минимальными побочными эффектами (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , представленный в 2012 году на 64-й ежегодной Американской Академии Неврологии. планирует переехать ASOs ждем второй этап испытаний в настоящее время в стадии реализации. <pкласс = "jove_content"> В то время как ориентации СОД1 была первая демонстрация использования ASOs для лечения неврологических заболеваний, ряд других исследований, так как была выполнена глядя на различные заболевания и их белковые мишени. В 2010 и 2011, больным СПИДом, что сдвиг сплайсинга белка выживания двигательных нейронов 2 (SMN2) были использованы в трансгенных мышиных моделей спинной мышечной атрофии (SMA) и привела к значительному улучшению фенотипа заболевания 11,12. Эти сплайсинга ASOs сейчас находятся в первой фазы клинических испытаний у детей с SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Кроме того, недавно было показано, что переходные управление ССО направленные против гена хантингтина смогли резко спасти мышиной модели Хантингтона, даже после того, уровни белка хантингтина возвращались к исходным 13.Во всех этих исследованиях, больным СПИДом были доставлены в боковой желудочек для уменьшения общего уровня гена или изменить сплайсинга гена черезвсей ЦНС. Оба осмотические насосы и одной инъекции болюса может быть использован для доставки ASOs в CSF. Насосы позволяют медленно, непрерывной доставки, в то время как интрацеребровентрикулярный (ICV) болюсной является быстрым, одноразовые инъекции. Мы использовали оба этих метода с успехом, хотя мы не сообщается непосредственное сравнение между насосом и болюса в одном трансгенной линии.
Использование ASOs в ЦНС является эффективным способом уменьшения уровня общего белка и / или изменения сплайсинга несколько белков. Хотя мы используем ASOs исключительно для лечения неврологических расстройств, мы признаем, что в других областях могут также воспользоваться этой техникой. Пока интерес белок экспрессируется в ЦНС и конечной целью является достижение CNS-широкий изменения в экспрессии генов, используя ASOs в продемонстрированы методы могут быть очень полезны.
Возможность доставки наркотиков на глобальном уровне в центральной нервной системе, как показано на видео является чрезвычайно мощная техника, которая легко и освоении и использовании. С практикой одного имплантации насоса или ICV болюса может быть завершена в течение 10 мин, что обеспечивает большой популяции мышей, подлежащего лечению, в то же время. Это особенно полезно для исследования с поведенческими считывания, а для большего числа поведение мыши имеют решающее значение, чтобы помочь увидеть существенные различия.
Основываясь на нашем опыте предоставления услуг больным СПИДом с помощью насосов и болюсов, мы наблюдали некоторые преимущества и недостатки каждого метода. Следует отметить, что это мнение в нашей лаборатории, и не может быть верно для всех мышей и крыс моделей.
Мы находим Преимущество использования насосов является их способность обеспечивать высокое количество ASO с ASO распространяется на гораздо более длительный период времени. Как правило, это приравнивается к более устойчивой нокдаун или после активного сращиванияASO вливания, хотя это не всегда может быть дело. Насосы также позволяют какие-либо конкретные сроки поставки ASO (14 дней, 28 дней или 42 дней), и насосы могут быть установлены только, чтобы еще дольше активного вливания ASO. Тем не менее, мы заметили, что изменение насосов более одного раза увеличивает изменчивость в связи с образованием волокнистого кармана вокруг насоса, которые предотвращают насоса от должным образом поглощать жидкость. Недостатком насосов является то, что некоторые мыши не переносят насоса, а также другие. Если трансгенной линии вы работаете с более хрупкая, насос может быть слишком громоздким. Насосы также должны быть удалены после окончательного вливания, подвергая мышей в другой операции и добавленной анестезии. Если поведение делает работу, это особенно важно, чтобы удалить насоса и позволяют по крайней мере 1-2 недель восстановления, поскольку присутствие насоса будет влиять некоторые поведения у мышей.
С ICV болюсной инъекции, одним из преимуществ является стоимость. Существуетпервоначальные вложения приобрести шприцы и иглы, но с течением времени, болюсов являются более экономически эффективным, так как нет никаких насосов / труб / катетеры для покупки. В целом, существует меньше вверх сохранить с ICV-инъекции болюса из-за отсутствия канюли и насосов. Мы также обнаружили, что ICV болюс может быть использован для доставки ASOs молодым и / или более хрупкими мышей. Недостатком ICV болюса является то, что одной инъекции. Не так много общего ASO могут быть доставлены по этому маршруту, и если продолжительность действия ASO используется короткая, нокдаун / сращивания эффект также будет недолгим.
Оба осмотические насосы, а также БМП болюса иметь возможность доставить больным СПИДом, что может Нокдаун белки или изменить сплайсинг генов во всей ЦНС грызунов, техника, которая имеет широкое применение в неврологии нескольких смежных областях. Мы предлагаем пилотирования обоих методов доставки, если вы не уверены, какой путь введения лучше всего подходит для вашего ыpecific исследования.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Курта Мазер от Isis Pharmaceuticals за оказание консультативных услуг, относящихся к операции ICV болюса, а также Isis Pharmaceuticals в целом для подачи нашей лаборатории с больным СПИДом. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Кэри Shaner за рецензирование этой статьи. ТММ и SLD поддерживается NIH гранты P50AG005681, K08NS074194 и R01NS078398.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027″, OD: 0.045″ |
0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
.2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
50 ml Conical Tubes | |||
100% Ethanol | |||
PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
Alcohol Pads | Select | #521 | |
Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
Antibiotic Cream | |||
Eye Ointment | |||
Electric Shaver | |||
70% Ethanol | |||
10% Provadone Iodine | |||
3% Hydogen Peroxide | |||
Warming Pad | |||
Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
Oxygen/Isoflurane System |