Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën
Summary
Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.
Abstract
Een punch biopsie van de huid wordt vaak gebruikt om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) te kwantificeren voor de diagnose van perifere polyneuropathie 1,2. Momenteel is het gebruikelijk om 3 mm huid biopten te verzamelen van het distale been (DL) en proximale dij (PT) voor de beoordeling van lengte-afhankelijke polyneuropathieën 3. Echter, vanwege de aard van multidirectionele IENFs, is het een uitdaging om te onderzoeken overlappende zenuwstructuren door de analyse van tweedimensionale (2D) beeldvorming. Alternatief zou driedimensionale (3D) beeldvorming een betere oplossing voor dit dilemma.
In het huidige rapport presenteren we methoden voor de toepassing van 3D-beeldvorming om pijnlijke neuropathie (PN) te bestuderen. Om IENFs identificeren, zijn huid monsters verwerkt voor immunofluorescent analyse van eiwit-genproduct 9,5 (PGP), een pan neuronale marker. Op dit moment is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathie behulp IENFD ontmoedigen diagnosticerenbepaald door immunohistochemie met PGP helderveld microscopie 4. In de huidige studie, dubbele immunofluorescentie-analyse pasten wij aan totale IENFD identificeren, PGP en nociceptieve IENF, door het gebruik van antilichamen die tropomyosine-receptor-kinase herkennen A (Trk A), de hoge affiniteit receptor voor zenuwgroeifactor 5. De voordelen van co-kleuring IENF met PGP en Trk A antilichamen ten goede aan de studie van PN door duidelijke kleuring PGP-positieve, nociceptieve vezels. Deze fluorescerende signalen kunnen worden gekwantificeerd om nociceptieve IENFD en morfologische veranderingen van IENF geassocieerd met PN bepalen. De fluorescerende beelden worden overgenomen door confocale microscopie en verwerkt voor 3D-analyse. 3D-imaging biedt rotatie capaciteiten om verder te analyseren morfologische veranderingen geassocieerd met PN. Samen genomen, fluorescerende co-kleuring, confocale imaging en 3D-analyse duidelijk ten goede aan de studie van PN.
Introduction
Momenteel is het gebruikelijk voor artsen om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) kwantificeren van de huid stansbiopsieën, die kan worden gebruikt om kleine vezels neuropathieën 3, 6-8 diagnosticeren. Biopten worden genomen uit de distale been (DL), 10 cm boven de laterale malleolus, en de proximale dij (PT), 20 cm onder de voorste iliaca wervelkolom 9. Alle IENF worden geëtiketteerd met proteïnegen product 9,5 (PGP), een pan neuronale marker 10-12. Momenteel is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathieën middels diagnosticeren IENFD bepaald door kleuring met PGP helderveld microscopie 6. Daarnaast hebben verschillende onderzoeksgroepen gebruikt immunofluorescerende protocollen voor PGP immunohistochemie 7-9. Kleine vezels neuropathie wordt vaak geassocieerd met neuropathische pijn. Om de rol van IENF essentieel voor pijn verwerking verder begrijpen we een techniek ontwikkeld om samenwerking label totale IENF met vezels die pijn produceren. Nociceptieve IENF, specifiek Aδ en C-vezels, kan worden bestudeerd door de co-etikettering van IENF met PGP en de nociceptieve marker, tropomyosine-receptor-kinase A (Trk A) 5. TrkA is de hoge affiniteit receptor voor zenuwgroei-factor die essentieel is voor de ontwikkeling van nociceptie. De Trk A-positieve nociceptieve zenuwvezels zijn peptidergisch vezels die express substance P (SP) en calcitonine gen gerelateerd peptide (CGRP). Voorheen Lauria en collega's paste de dubbel-labeling techniek om PN, co-labeling PGP-positieve IENF met een nociceptieve marker 10 bestuderen. In onze eerdere studie hebben we aangetoond dat Trk A-positief IENF, maar niet Trk A-negatieve IENF werden opgereguleerd in een diermodel van pijnlijke diabetische neuropathie 5. Deze co-labeling techniek biedt de mogelijkheid om te vergelijken kwantificering van nociceptieve IENFD aan IENFD en het vermogen om morfologische veranderingen geassocieerd met PN bestuderen totaal. De mogelijkheid om nociceptieve IENF en bedrij visualiserenre kwantificering van totaal IENFD tot nociceptieve IENFD kan objectief bewijs voor de aanwezigheid van pijn en mogelijk inzicht in de ernst van pijn bij PN. Deze techniek is ook toepasbaar op huid van diermodellen. In vergelijking met eerdere studies, het huidige protocol beschrijft methoden voor 3D beeldanalyse, het creëren van de mogelijkheid om fouten die kunnen optreden in 2D beeldanalyse voorkomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meting van IENFD is op grote schaal gebruikt om de mate van perifere neuropathieën 13,14 bepalen. Momenteel is de meest gebruikte protocol meet alleen de dichtheden van zenuwvezels die de basale membraan van de epidermis doordringen, het niet in aanmerking nemen axonale vertakkingen en / of morfologische veranderingen van de zenuwen. Bovendien heeft de huidige IENFD analyse niet aangetoond IENFD correleren met de aanwezigheid van pijn in PN 15.
We eerder gemeld dat ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies K08 NS061039-01A2, het programma voor Neurology Research & Discovery en The A. Alfred Taubman Medical Research Institute van de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikt de morfologie en beeldanalyse Kern van de Michigan Diabetes Research en Training Center, gefinancierd door de National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 van het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en Kidney Diseases. De auteurs willen graag Robinson Singleton en Gordon Smith (Universiteit van Utah) bedanken voor hun gulle donatie van menselijke huid monsters aan de initiële ontwikkeling van de nociceptieve biomarker immunohistochemie techniek ondersteunen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
