Summary

Séparation de<em> Plasmodium falciparum</em> Late Phase érythrocytes infectés par des moyens magnétiques

Published: March 02, 2013
doi:

Summary

Les propriétés paramagnétiques de hémozoïne sont utilisés pour isoler les stades tardifs de la<em> Plasmodium falciparum</em>-Globules rouges infectés en culture. La méthode est simple et rapide et ne pas affecter les capacités suivantes invasives des parasites.

Abstract

Contrairement aux autres espèces de Plasmodium, P. falciparum peuvent être cultivées en laboratoire, ce qui facilite son étude 1. Alors que la parasitémie atteint peut atteindre la limite ≈ 40%, le chercheur conserve généralement le pourcentage d'environ 10%. Dans de nombreux cas, il est nécessaire d'isoler les cellules du parasite contenant globules rouges (hématies) de ceux non infectés, afin d'enrichir la culture et de procéder à une expérience donnée.

Lorsque P. falciparum infecte les érythrocytes, le parasite se dégrade et se nourrit de l'hémoglobine 2, 3. Cependant, le parasite doit faire face à un groupement hème contenant du fer très toxique 4, 5. Le parasite échappe de sa toxicité en transformant l'hème en un polymère à cristaux inertes appelé hémozoïne 6, 7. Cette molécule contenant du fer est stocké dans sa vacuole alimentaire et le métal en elle possède un état ​​d'oxydation différent de l'une à l'hème 8. L'état ferrique en fer de l'hèmeozoin lui confère une propriété paramagnétique absente dans les érythrocytes non infectés. Comme le parasite envahit atteint sa maturité, le contenu de hémozoïne augmente également 9, qui confère paramagnétisme encore plus sur les derniers stades de P. falciparum à l'intérieur du globule rouge.

Sur la base de cette propriété paramagnétique, les dernières étapes de P. falciparum cellules sanguines infectée-rouge peuvent être séparées par le passage de la culture à travers une colonne contenant des billes magnétiques. Ces billes se magnétique lorsque les colonnes les contenant sont placés sur un support d'aimant. Globules rouges infectés, en raison de leur paramagnétisme, sera alors coincé à l'intérieur de la colonne, tandis que le flux continu contiendra, pour la plupart, les érythrocytes non infectés et les stades précoces contenant du parasite.

Ici, nous décrivons la méthode d'enrichir la population de parasites stade avancé avec des colonnes magnétiques, ce qui maintient la viabilité du parasite bon 10.Après avoir effectué cette procédure, la culture libre peut être renvoyé dans un incubateur pour permettre aux parasites restants de continuer à croître.

Protocol

Toutes les étapes du protocole, à l'exception des centrifugations, doit être effectuée sous une hotte pour garder l'échantillon stérile. 1. Isolation Late Stage de P. érythrocytes infectés par P. falciparum Tous les stades de Plasmodium érythrocytes infectés peuvent être séparés par cette méthode, car hémozoïne, qui confère paramagnétisme sur le parasite, est un métabolite commun au genre. Une parasitémie élevée (3-10…

Representative Results

Dans la figure 2, la culture en passant par la colonne magnétique est montré, avant (A) et après la procédure (B). Une à deux érythrocytes infectés sont généralement vus sur un champ de grossissement 100X comme le montre la figure 2, les flèches pointant vers érythrocytes infectés dans la figure 2A. Dans une procédure typique, à commencer par une culture de la parasitémie 5% (figure 2A), la performance de…

Discussion

Des cultures in vitro de la malaria parasite P. falciparum présentent une parasitémie limitée, avec plus de la moitié des globules rouges non infectés au point le plus élevé de prolifération de la culture. Pour la plupart des expériences de recherche, il est souhaitable de travailler uniquement avec les érythrocytes infectés. À cette fin, une technique de séparation est nécessaire de diviser la culture en fonction de l'infection. Méthodes utiles comprennent l'utilisation…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par des subventions PRB-009 à CS et une bourse de doctorat à LC, de la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
RPMI 1640 Hepes Modified Sigma-Aldrich R4130 Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate
MidiMACS Separator MACS Miltenyi BioTec 130-042-302
MACS MultiStand MACS Miltenyi BioTec 130-042-303
LS Columns MACS Miltenyi BioTec 130-042-401
Hemacytometer Grafco Grafco Neubauer Chamber Can be found through many other suppliers

References

  1. Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
  2. Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
  3. Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
  4. Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
  5. Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
  6. Egan, T. J. Haemozoin formation. Mol. Biochem. Parasitol. 157 (2), 127-136 (2008).
  7. Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
  8. Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
  9. Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
  10. Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
  11. Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
  12. Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
  13. Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
  14. Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
  15. Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
  16. Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
  17. Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).

Play Video

Cite This Article
Coronado, L. M., Tayler, N. M., Correa, R., Giovani, R. M., Spadafora, C. Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means. J. Vis. Exp. (73), e50342, doi:10.3791/50342 (2013).

View Video