Recombineering homolog rekombination konstruktioner i<em> Drosophila</em
Summary
Homolog rekombinationsteknikker høj grad fremme<em> Drosophila</em> Genetik ved at muliggøre skabelsen af molekylært præcise mutationer. Den nylige vedtagelse af recombineering tillader en at manipulere store stykker af DNA og omdanne dem til<em> Drosophila</em<sup> 6</sup>. De metoder, der præsenteres her kombinere disse teknikker til hurtigt at frembringe store homologe rekombinationsvektorer.
Abstract
Den fortsatte udvikling af teknikker til hurtig, storstilet manipulation af endogene gen loci vil udvide brugen af Drosophila melanogaster som en genetisk model organisme til menneske-sygdom relateret forskning. De seneste år har set tekniske fremskridt som homolog rekombination og recombineering. Imidlertid genererer utvetydige null mutationer eller kodning endogene proteiner fortsat en betydelig indsats for de fleste gener. Her beskriver vi og demonstrere teknikker til at bruge recombineering-baseret kloning metoder til at generere vektorer, der kan bruges til at målrette og manipulere endogene loci in vivo Konkret har vi etableret en kombination af tre teknologier:. (1) BAC transgenese / recombineering, ( 2) ender ud homolog rekombination og (3) Gateway teknologi til at give en robust, effektiv og fleksibel metode til at manipulere endogene genomiske loci. I denne protokol, giver vi trin-for-trin oplysninger om, hvordan (1) design individual vektorer, (2) hvordan man klone store fragmenter af genomisk DNA i homolog rekombination vektor hjælp hul reparation, og (3) hvordan man udskifter eller tagge gener af interesse inden for disse vektorer ved hjælp af en anden runde af recombineering. Endelig vil vi også give en protokol for, hvordan at mobilisere disse kassetter in vivo til at generere en knockout, eller et kodet gen via knock-in. Disse metoder kan nemt blive vedtaget for flere mål parallelt og give et middel til at manipulere Drosophila genomet på en rettidig og effektiv måde.
Introduction
Rengør molekylært definerede manipulationer af enkelte gener på deres endogene loci tilbyde et uvurderligt værktøj til at studere et utal af spørgsmål vedrørende eukaryot biologi. Drosophila vende genetiske teknikker til at generere tab af funktions alleler havde vist sig at være udfordrende, indtil Golic og kolleger indført i vivo gen-targeting hjælp homolog rekombination til Drosophila 1-3. De viste, at specifikke genomiske loci kan målrettes ved hjælp af en lineær DNA-fragment fra en integreret transgene konstrukt. Denne lineære "donor" DNA genereres in vivo gennem FRT-medieret rekombination (at udskære DNA'et fra kromosomet som en cirkulær molekyle) efterfulgt af linearisering med meganuclease I-Scel. Selv om denne metode er blevet anvendt til at generere en række definerede læsioner, har teknikken ikke været let skalerbar til manipulation af adskillige gener parallelt fordi hver individueldual knockout konstruktion kræver tydelig og custom design. For eksempel, ofte vanskeligheder med problemfrit manipulere store fragmenter af DNA (> 5 kb) in vitro under anvendelse af klassisk restriktionsenzym / ligering kloning eller PCR, samt størrelsen begrænsningerne ved traditionel in vivo transformationsvektorer interferere med hurtig etablering af homolog rekombination målretning vektorer. For at overvinde disse begrænsninger, kombineret vi recombineering / transgenese P [acman], der giver mulighed sub-kloning og transgenese på op til 100 kb DNA, med enderne-out gene targeting metode til at etablere en effektiv og relativt hurtige platform, letter Drosophila gene targeting.
Rekombination-medieret genteknologi (recombineering) er en kraftfuld homolog rekombination-baseret kloning teknologi 4,5. I modsætning til konventionel restriktionsenzym / ligase kloning recombineering ikke begrænset af den sekvens eller size af manipulerede DNA. Recombineering bruger en speciel E. coli-stamme, som huser rekombination maskiner leveret af en defekt λ profag 4.. Denne teknik er for nylig blevet godkendt til brug i Drosophila 6,7. Recombineering i Drosophila bygger på en modificeret betinget opformerbart bakteriel kunstigt kromosom (BAC), vektor kaldet P [acman] 6,7. Denne vektor bærer to replikationsoriginer: oriV, som producerer høj-kopiantal ved kemisk induktion til oprensning af store mængder DNA, der kræves til sekventering og embryo injektion og oris, som opretholder lave kopiantal under basale betingelser. Derudover P [acman] vektor er udstyret med en bakteriel fastgørelse (attB) site. Den attB stedet tjener som et substrat for ΦC31 integrase-medieret transgenese der tillader inkorporering af store DNA-fragmenter ind i en forudbestemt landing site inden Drosophila genomet 8,9.
Vi har genereret en P [acman] vektor (benævnt P [acman]-KO 1.0), der kan bruges som et targeting vektor for ender ud homolog rekombination 10,11. At inkorporere ender ud gentargeting teknologi i systemet, tilføjede vi to FRT og to I-SCEI sites. Vi har også inkluderet en Gateway kassette inden for denne ændrede vektor til at strømline processen med at indarbejde homologiarmene til P [acman]-KO 1.0. Dette giver en hurtig og enkel måde at introducere næsten enhver genomisk region af interesse i målvektoren. I denne protokol vil vi beskrive, hvordan man konstruere en målvektor hjælp af P [acman]-KO 1.0 og hvordan man mobiliserer denne vektor in vivo at målrette endogene locus. Med henblik på denne protokol vil vi anvende RFP / Kan kassette at erstatte et gen af interesse, men en række kassetter, der indeholder en antibiotisk selektionsmarkør kan bruges med denne protokol. Vi har designet og med held anvendt en række kassettergenudskiftning og tagging 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Styrken af genetiske modelorganismer inden for biomedicinsk forskning er i høj grad baseret på de tilgængelige værktøjer til genetisk manipulation. De små modeller C. elegans og Drosophila især muliggøre billig og hurtig molekylærgenetiske analyser af komplette veje og genfamilier impliceret i flercellede udvikling eller funktion. De seneste år har set betydelige fremskridt i værktøj udvikling for at manipulere gener i Drosophila 14,15. For eksempel blev recombinee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Hugo Bellen og Bloomington Stock Center for reagenser. Vi yderligere takker Koen Venken, Hugo Bellen og alle medlemmer af Buszczak og Hiesinger labs for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Health i ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) samt MB (RO1GM086647), et tilskud af Cancer Prevention Research Institute of Texas til MB og PRH (RP100516) og Welch Foundation (I-1657) til PRH. MB er en EE og Greer Garson Fogelson Scholar i biomedicinsk forskning og PRH er en Eugene McDermott Scholar i biomedicinsk forskning på UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
- Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
- Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
- Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
- Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
