における相同組換えコンストラクトを遺伝子改変<em>ショウジョウバエ</em
Summary
相同組換え技術は大きく前進<em>ショウジョウバエ</em>分子正確な突然変異の作成を可能にすることによって、遺伝学。コンビニアリングの最近の採用は1つがDNAの大部分を操作し、にそれらを変換することができます<em>ショウジョウバエ</em<sup> 6</sup>。方法は、急速に大規模な相同組換えベクターを生成するためにこれらの技術を組み合わせて、ここで提示した。
Abstract
内因性遺伝子座の高速、大規模な操作のための技術の継続的な開発は、ヒトの疾患関連の研究のための遺伝モデル生物としてキイロショウジョウバエの使用を広げるする。近年では、相同組換えとコンビニアリングなどの技術的な進歩を見てきました。しかし、明確なヌル突然変異またはタギング内因性タンパク質を生成することはほとんどの遺伝子のために相当な努力のまま。ここでは、 インビボで内因性遺伝子座を標的とし、操作するために使用することができるベクターを生成するためにコンビベースのクローニング方法を使用するための技術を記述し、実証具体的には、3つの技術の組み合わせを確立している：（1）BACの形質転換/コンビ、（ 2）端部アウト相同組換えおよび（3）ゲートウェイ技術は、内因性遺伝子座を操作するための堅牢な、効率的で柔軟な方法を提供することにある。このプロトコルでは、我々はどのように（1）設計individuaの約ステップバイステップの詳細を提供Lベクトルは、（2）ギャップの修復を使用して相同組換えベクターにゲノムDNAの大断片のクローンを作成する方法、および（3）コンビニアリングの第二ラウンドを使用して、これらのベクター内に目的の遺伝子を交換するか、タグにどのように。最後に、我々はまた、ノックアウト、またはノックイン経由タグ付けされた遺伝子を生成するために、生体内でこれらのカセットを動員する方法のためのプロトコルを提供する。これらの方法は、簡単に並列に複数のターゲットを採用し、タイムリーかつ効率的にショウジョウバエのゲノムを操作するための手段を提供することができます。
Introduction
彼らの内因性遺伝子座にある単一の遺伝子の分子的に定義された操作をきれいにすることは、真核生物に関連する質問の無数を研究するための貴重なツールを提供しています。 ショウジョウバエは、機能喪失対立遺伝子を生成するための遺伝学的手法を逆Golicと同僚に導入するまで挑戦することが証明されていた生体内遺伝子はショウジョウバエ 1-3に相同組換えを利用したターゲット。彼らは、その特定のゲノム遺伝子座が統合トランスジェニック構築物からのDNAの線状断片を用いて標的を実証することができる。この線形"ドナー" DNAはメガヌクレアーゼI-SceIを持つ線形続いFRT媒介組換え（物品税に環状分子として染色体からDNA）を通して生体内で生成されます。この方法は正常に定義された病変の様々を生成するために使用されているが、この技術は、並列で多数の遺伝子を操作するために容易に拡張されていないため、各INDIVIデュアルノックアウトコンストラクトははっきりとカスタム設計を必要とします。シームレスクラシカル制限酵素/ライゲーションクローニングやPCRならびに生体形質転換ベクターの伝統のサイズ制限はしばしば標的相同組換えの迅速な作成に干渉を用いたin vitroでの DNAの大断片（> 5 KB）を操作することで例えば、困難ベクトル。これらの制限を克服するために、我々はそれを効率的かつ比較的急速なプラットフォームを確立するための方法論をターゲット両端アウト遺伝子とDNAの100キロバイトまでのサブ·クローニングと遺伝子導入を可能にしますコンビニアリング/トランスジェネシスP [acman]システムを、組み合わせショウジョウバエの遺伝子ターゲティングが容易になります。
組み換え媒介遺伝子工学（コンビニアリング）は4,5パワフル相同組換えベースのクローン技術です。従来の制限酵素/リガーゼクローニングとは対照的に、コンビは、シーケンスまたはSIZに限定されるものではない操作したDNAの電子。コンビニアリングは、特別なE.を使用しています不良λプロファージ4で提供される組換え機構を宿す大腸菌株 。この技術は、最近ショウジョウバエ 6,7に採用されている。 ショウジョウバエのコンビニアリングはP [acman] 6,7と呼ばれる修正された条件に応じて増幅細菌人工染色体（BAC）ベクターに依存しています。 ORIV、シーケンシングおよび胚の注入および基底条件下で低コピー数を維持オリスに必要なDNAの大量の精製のための化学誘導時に高コピー数を生成します。このベクターは、複製の二起源を運ぶ。さらに、P [acman]ベクターは細菌の付着（のattB）サイトが装備されています。のattBサイトは、 ショウジョウバエのゲノム8,9内の所定の着陸地点に大きなDNA断片の取り込みを可能にΦC31インテグ媒介形質転換のための基質として機能します。
我々は、両端アウト相同組換え10,11のためのターゲティングベクターとして使用することができるP [acman]ベクトル（P [acman]-KO 1.0と呼ぶ）が生成されている。システムに技術をターゲット両端アウト遺伝子組み込むには、我々は2つのFRTと2 I-SceI制限酵素サイトを追加しました。また、P [acman]-KO 1.0にホモロジーアームを組み込むプロセスを合理化するために、この修正されたベクター内のゲートウェイカセットが含まれている。これは、ターゲティングベクターに関心の事実上すべてのゲノム領域を導入するための迅速かつ簡単な方法を提供します。このプロトコルでは、P [acman]-KO 1.0、そしてどのように内因性遺伝子座を標的とするin vivoでこのベクトルを動員するを使用してターゲティングベクターを設計する方法について説明します。このプロトコルの目的のために、我々は、目的の遺伝子を置換するRFP /菅カセットを使用するが、抗生物質選択マーカーを含有するカセットの様々なこのプロトコルで使用することができる。私たちは、カセットのセットのために設計されており、正常に使用している遺伝子置換およびタギング10,11。
Protocol
Representative Results
Discussion
生物医学研究における遺伝的モデル生物の力は、主に遺伝子操作のために利用可能なツールに基づいています。小さ なモデルC.特に虫とショウジョウバエは、多細胞発達や機能に関与して、完全な経路および遺伝子ファミリーの、安価で高速な分子遺伝学的解析が可能になります。近年は、 ショウジョウバエ 14,15の遺伝子を操作するためのツールの開?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ヒューゴBellenと試薬用ブルーミントンストックセンターに感謝したいと思います。我々はさらに有用な議論のために公園Venken、ヒューゴBellenとBuszczakとHiesingerラボのすべてのメンバーに感謝します。この作品は、ACRの国立衛生研究所（T32GM083831）、PRH（RO1EY018884）からの補助金によってとMB（RO1GM086647）、MBとPRH（RP100516）にテキサス州のがん予防研究所によって助成金、およびウェルチにサポートされていましたPRHへ財団（I-1657）。 MBは、生物医学研究におけるEEとグリア·ガーソンFogelson大学者で、PRHは、UTの南西医療センターの生物医学研究におけるユージンマクダーモット学者です。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
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