Recombineering homolog rekombinasjon konstruerer i<em> Drosophila</em

Summary

Homolog rekombinasjon teknikker sterkt fremme<em> Drosophila</em> Genetikk ved å muliggjøre etableringen av molekylært presise mutasjoner. Den nylige innføringen av recombineering gjør det mulig å manipulere store biter av DNA og forvandle dem til<em> Drosophila</em⁶. Metodene som presenteres her kombinere disse teknikkene til å raskt generere store homolog rekombinasjon vektorer.

Abstract

Den videre utviklingen av teknikker for rask, storskala manipulering av endogene genloci vil utvide bruken av Drosophila melanogaster som en genetisk modell organisme for human-sykdom forskning. De siste årene har tekniske fremskritt som homolog rekombinasjon og recombineering. Men generere entydige null mutasjoner eller tagging endogene proteiner fortsatt en betydelig innsats for de fleste gener. Her beskriver vi og demonstrerer teknikker for bruk av recombineering-baserte metoder for kloning for å generere vektorer som kan brukes for å målrette og manipulere endogene loci in vivo Konkret er det etablert en kombinasjon av tre forhold: (1). BAC transgenesis / recombineering, ( 2) ender ut homolog rekombinasjon og (3) Gateway teknologi for å gi en robust, effektiv og fleksibel metode for å manipulere endogene genomisk loci. I denne protokollen, gir vi trinn-for-trinn detaljer om hvordan du (1) utforming individual vektorer, (2) hvordan å klone store fragmenter av genomisk DNA inn i homolog rekombinasjon vektor ved hjelp av gap reparasjon, og (3) hvordan å erstatte eller merke gener av interesse innenfor disse vektorer ved hjelp av en ny runde med recombineering. Til slutt vil vi også gi en protokoll for hvordan å mobilisere disse kassetter in vivo for å generere en knockout, eller en merket genet via knock-in. Disse metodene kan lett bli vedtatt for flere mål i parallell og gi et middel for å manipulere Drosophila genomet på en riktig og effektiv måte.

Introduction

Rengjør molekylært-definerte manipulasjoner av single gener på deres endogene loci tilby et uvurderlig verktøy for å studere et mylder av spørsmål som er relevante for eukaryote biologi. Reversere Drosophila genetiske teknikker for å generere tap-av-funksjon alleler hadde vist seg å være utfordrende til Golić og kolleger introdusert i vivo gene targeting bruke homolog rekombinasjon til Drosophila ^1-3. De viste at bestemte genomiske loci kan man ved å bruke et lineært fragment av DNA fra et integrert transgen konstrukt. Denne lineære "donor" DNA er generert in vivo ved FRT-mediert rekombinasjon (å skjære DNA fra kromosomet som et sirkulært molekyl) etterfulgt av linearisering med meganuclease I-SCEI. Selv om denne metoden har blitt brukt til å generere et antall definerte lesjoner, har teknikken ikke vært lett skalerbar for manipulering av mange gener i parallell fordi hvert enkeltdual knockout konstruere krever tydelig og tilpasset design. For eksempel, vanskeligheter sømløst manipulere store fragmenter av DNA (> 5 kb) in vitro ved bruk av klassisk restriksjonsenzym / ligering kloning eller PCR, samt størrelse begrensninger på tradisjonell in vivo transformasjon vektorer ofte i konflikt med rask etablering av homolog rekombinasjon målretting vektorer. For å overvinne disse begrensninger kombinerte vi den recombineering / transgenesis P [ACMAN]-system, som tillater den sub-kloning og transgenesis på opptil 100 kb av DNA, med endene ut-genet targeting metode for å etablere en effektiv og relativ rask plattformen forenkler Drosophila gene targeting.

Rekombinasjon-mediert genteknologi (recombineering) er en kraftig homolog rekombinasjon-baserte kloning teknologi ^4,5. I motsetning til konvensjonelle restriksjonsenzym / ligase kloning, er recombineering ikke begrenset av sekvensen eller size av den manipulerte DNA. Recombineering bruker en spesiell E. coli stamme som havner rekombinasjon maskiner levert av en defekt λ prophage ^fire. Denne teknikken har nylig blitt tatt i bruk i Drosophila ^6,7. Recombineering i Drosophila er avhengig av en modifisert betinget amplifibart bakteriell kunstig kromosom (BAC) vektor kalt P [ACMAN] ^6,7. Dette vektor bærer to opprinnelsen til replikering: OriV, som produserer high-kopi nummer etter kjemisk induksjon for rensing av store mengder DNA som kreves for sekvensering og embryo injeksjon og åpninger, som opprettholder lav-kopi nummer under basale forhold. I tillegg, P [ACMAN] vektor er utstyrt med en bakteriell tilknytningssted (attB) område. Den attB området fungerer som et substrat for ΦC31 integrase-mediert transgenesis som gjør at inkorporering av store DNA-fragmenter til en forhåndsbestemt landingssted i Drosophila genom ^8,9.

Vi har generert en P [ACMAN] vektor (referert til som P [ACMAN]-KO 1,0) som kan bli brukt som en målsøkende vektor for-ender ut homolog rekombinasjon ^10,11. Å innlemme ender ut gene targeting teknologi inn i systemet, la vi to FRT og to I-SCEI nettsteder. Vi har også inkludert en Gateway kassett innenfor denne modifiserte vektor for å effektivisere prosessen med å innlemme de homologidomene armene i P [ACMAN]-KO 1.0. Dette gir en hurtig og enkel måte å innføre praktisk talt en hvilken som helst genomisk region av interesse i målrettingsverdien vektor. I denne protokollen vil vi beskrive hvordan du ingeniør en målretting vektor ved hjelp av P [ACMAN]-KO 1.0, og hvordan å mobilisere denne vektor in vivo å målrette den endogene locus. For formålet med denne protokollen vil vi bruke RFP / Kan kassett som erstatter et gen av interesse, men en rekke kassetter som inneholder et antibiotikum seleksjonsmarkør kan brukes med denne protokoll. Vi har designet og hell brukt et sett med kassetter forgenet utskifting og tagging ^10,11.

Protocol

En. Valg av BAC og regionen til Target Å skaffe seg en BAC med genet av interesse (GOI) (her CG32095 brukes som et eksempel), søk etter CG32095 på www.flybase.org . Under avsnittet aksjer og reagenser, sjekk avsnittet, "Genomiske Clones" for BACS inneholder CG32095. Kontroller at BAC inkluderer minst 10 kb oppstrøms og 5 kb nedstrøms genet av interesse. Alternativt kan kloner i P [ACMAN] vektor 7 også bl…

Representative Results

Forsterkning av LA og RA homologidomene armene skal produsere 500 bp produkter og PCR-SOE reaksjon bør gi en 1,0 kb produkt (§ § 2.1 til 2.4, figur 2). BP reaksjon utført i avsnitt 2.5 er vanligvis svært effektiv og bakteriell transformasjon av produktet gir 5-100 kolonier i gjennomsnitt. Nesten alle koloniene testet med PCR sjekk viser det forventede PCR produktet. I løpet av den første runden av recombineering (§ 3) forventer å få 20-40 kolonier etter transformas…

Discussion

Kraften av genetiske modellorganismer i biomedisinsk forskning er i stor grad basert på de verktøyene som er tilgjengelige for genetisk manipulasjon. De små modeller C. elegans og Drosophila spesielt tillate for billig og rask molekylærgenetiske analyser av komplette stier og genet familier innblandet i flercellede utvikling eller funksjon. Siste årene har sett betydelige fremskritt innen verktøy utvikling for å manipulere gener i Drosophila ^14,15. For eksempel ble recombinee…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
SW102 Recombination competent bacteria	NCI-Frederick	Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106)	http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli	Epicentre	EC300110	Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Aligent Technology Inc.	600670
BamHI-HF	New England Biolabs	R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit	Invitrogen	11789-020
P[acman]KO1.010	Buszczak and Hiesinger Labs	Upon request
pENTR RFP-Kan11	Buszczak and Hiesinger Labs	Upon request
Flystocks	Bloomington stock center	Stock numbers: 25680, 25679	y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine	Biorad GenePulser Xcell with PC module	165-2662
Cuvettes	Fisher Brand	#FB101