Identification de Motifs Fonctionnelles et leurs PARTENAIRES DE LIAISON Peptide-basée sur

Summary

Techniques pour disséquer les mécanismes qui sous-tendent la sécrétion de HIV-1 Nef dans exosomes sont décrits. Peptides courts spécifiques provenant de Nef et la transfection de protéines ont été exploités pour déterminer la structure, la fonction et les partenaires de liaison de la sécrétion Modification de la région de Nef. Ces procédures présentent un intérêt général dans de nombreuses études mécanistes.

Abstract

Peptides courts spécifiques sont dérivés à partir de motifs trouvés dans les protéines full-longueur, dans notre cas le VIH-1 Nef, non seulement conservent leur fonction biologique, mais peuvent également inhiber de manière compétitive le fonction de la protéine full-length. Un ensemble de 20 Nef peptides de numérisation, 20 acides aminés dans longueur les uns avec les qui se chevauchent 10 acides aminés de son voisin, ont été utilisés pour identifier des motifs dans Nef responsable pour son induction de l'apoptose. Peptides contenant des ces motifs apoptotiques induites l'apoptose à des niveaux comparables à la protéine de Nef full-length. A second peptide, dérivé à partir de la région de la Modification de Sécrétion (SMR) de Nef, a conservé le capacité à interagir avec des protéines cellulaires impliqués dans la sécrétion de Nef dans exosomes (exNef). Ce peptide SMRwt a été utilisé comme la protéine "d'appât" dans des expériences de co-immunoprécipitation pour isoler les protéines cellulaires qui se lient spécifiquement au motif de la SMR de Nef. Protein transfection et de l'anticorps inhibition a été utilisé pour perturber physiquement le pari de interactionween Nef et mortaline, l'un des les protéines SMR-de liaison isolés, et l'effet a été mesurée avec un dosage de sécrétion exNef fluorescent-basée sur. La capacité de la SMRwt peptide à outcompete Nef full-length pour des protéines cellulaires qui se lient le motif de SMR, assurez-il le premier inhibiteur de la sécrétion exNef. Ainsi, par employant les techniques décrites ici, qui utilisent la les propriétés uniques de peptides courts spécifiques dérivés à partir de motifs trouvés dans les protéines full-longueur, on peut accélérer l'identification de motifs fonctionnels dans les protéines et le développement d'inhibiteurs de fonctions de pathogènes peptide-basés sur.

Introduction

Avec l'avènement de thérapie anti-rétrovirale, l'épidémie de SIDA dans le monde occidental a été ralentie, mais pas écourtée, et la propagation du VIH continue d'être un majeur fardeau de santé tout au long de le monde. Avec l'exception de le procès marginalement efficaces l'essai RV144 Thai, vaccins contre le VIH ont jusqu'ici montré échec pour protéger à partir de infection. Ainsi, la recherche en cibles thérapeutiques supplémentaires, potentiels est encore justifié.

Le long de avec CD4 l'épuisement T-cellule, l'activation immunitaire généralisée persistante est un marque de fabrique de infection à VIH. Cette Activation Immune Chronic (CIA) mène à augmente dans chiffre d'affaires de la cellule, sous-populations lymphocytaires activés et différenciées, l'épuisement cellulaire et de la sénescence, et le meurtre de cellules T et les cellules B Via Activation-Induced Mort Cellulaire (AICD) ^1,2,3, et il est bien établi comme l'un des les prédicteurs les les plus forts de progression de la maladie ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12.} Cependant, les mécanismes qui sous-tend CIA et CD4L'épuisement dans l'infection le VIH T-cellule restent à être pleinement élucidé.

Evidence à partir de notre laboratoire et d'autres nous a conduit à un modèle pour progression de la maladie (Figure 1) dans laquelle la Nef de protéine du VIH (Regulatory Factor Negative) induit sa sécrétion dans exosomes à partir de cellules infectés-1 lutte contre le VIH ^13,14. Ces exosomes Nef-contenant du (exNef) induisent des l'apoptose dans les un certain nombre de lignages cellulaires y compris les CD4 non infectées T-des cellules ^15,16. Alternativement, dans les monocytes / macrophages exNef altère les les modèles d'expression de gènes, les p. ex expression de cytokine, ET LE CODE APPARAÎT à induire un état ​​de l'activation immunitaire Non programmé. Ce corps de preuves suggère un rôle important pour exNef dans CIA et CD4 l'épuisement T-cellule.

Comprendre les mécanismes qui sous-tendent la capacité de Nef pour manipuler la voie de la traite des êtres exosomal sera utile dans nouveaux inhibiteurs d'ingénierie de la sécrétion exNef. Inhibition de la sécrétion exNef devrait diminuer l'épuisement T-cellule CD4et de la CIA que pathogenèse dur le VIH / sida.

Pour recueillir des les éléments de preuve qui a conduit à notre modèle pour progression de la maladie VIH / sida et les les données ultérieures qui ont construit sur ce modèle, nous avons développé un certain nombre de nouveaux réactifs et des méthodologies qui nous ont permis à analysons les la génétique de la sécrétion exNef, et commençons à déterminer la protéines cellulaires impliqués. Dans le travail initial, nous avons trouvé que la protéine Nef induit l'apoptose dans les cellules de bystander et est libéré extracellulairement à partir de cellules Nef-transfectées et le VIH-infectée ^15. Des peptides dérivés à partir de (cellule Stromal Derived Factor-1, avec l'épissage alternatif de alpha) SDF-1α avaient été précédemment montré pour conserver une grande partie de l'activité de liaison et la signalisation de la molécule full-length ^17. Nous avons spéculé que les peptides de Nef pourraient de retenir certains des le activité apoptotique de la protéine de pleine, et que ces peptides seraient contenir nécessairement le domaine apoptotique Nef (s). Pour identifier ces peptides, et par conséquent la Nefdomaine apoptotique (s), nous avons obtenu un ensemble de 20 du VIH-1 Nef peptides Numérisation à partir d'le recherche sur le sida NIH et Reagent Program de Référence. Ces peptides 20-aa, chaque qui se chevauchent 10 acides aminés de son voisin a, sont nommées par le nombre de leur dernier acide aminé, c.-à-N20 travées Nef acides aminés 1-20, N30 travées Nef acides aminés 11-30, etc ^16. Nous avons constaté que d'exposer T-cellules extracellulairement à des peptides spécifiques qui se chevauchent deux domaines 10-aa distinctes dans la protéine de Nef full-length l'apoptose induite dans ces cellules. Une analyse subséquente de ces peptides apoptotiques Nef-dérivées a révélé leur capacité à interagir physiquement avec le récepteur de chimiokine CXCR4 sur la surface de T-cellules, avec cinétique de liaison qui ont permis à ces peptides à inhibent de façon compétitive contraignant entre CXCR4 et son ligand naturel SDF-1α. Enfin, la interaction les peptides apoptotiques Nef-dérivées de avec CXCR4 a été trouvé à induire une réponse de stress dans ces T-cellules conduisant à l'apoptose. Cet élément de preuve nous a permis de quicdomaines fonctionnels de kly carte Nef; un processus qui aurait pris des beaucoup plus longtemps en utilisant des techniques mutagènes d'ADN standard tels que mutagenèse par balayage d'alanine. Il a également a montré que ces peptides Nef-dérivées de courtes conservés la fonction biologique de les domaines apoptotiques dans la protéine full-length.

Ayant identifié un rôle pour Nef extracellulaire, c.-à-l'apoptose des T-cellules, nous avons cherché une meilleure compréhension de la façon dont Nef a été sécrété à partir de cellules. En utilisant une série de constructions d'Nef mutées, nous avons cartographié motifs protéiques de Nef hautement conservées dans les régions N-terminaux de à la fois Nef le VIH, et de son Rhesus macaque équivalent SIV _mac (Simian Virus de l'Immunodéficience) Nef, qui sont critique pour exNef sécrétion ^13. One de ces motifs, la région de la Modification de Sécrétion (SMR; 66VGFPV70), était particulièrement critique, en tant que remplacement alanine de une quelconque de ses cinq acides aminés soit grandement réduit ou aboli la sécrétion d'exNef. Lorsque livré à cellules par l'intermédiaire la C de Active MotifHariot Protein Reagent de livraison, un peptide contenant la SMR attaché à un séquence d'peptide FLAG (SMRwt) a été trouvée il pour inhiber la la sécrétion d'exNef à partir de à la fois Nef-transfectée et le VIH-infectée cellules ^18. Basé sur notre expérience précédente avec peptides, nous avons décidé de utiliser cette peptide pour élucider les molécules et des mécanismes qui sous-tendent le rôle de l'Nef SMR dans sécrétion exNef.

Utilisation de la peptide SMRwt en tant que notre "protéine appât", nous avons co-immunoprécipitée à partenaires de liaison cellulaires de la SMR à partir de lysats T-cellules non infectées ^18. La séquence d'peptide FLAG a fourni une poignée commode pour capturant le peptide SMRwt en utilisant résine d'affinité anti-FLAG. Notre constatation antérieure selon laquelle un seul valine à l'alanine mutation dans le peptide SMRwt était suffisante pour que abolir son inhibition de la sécrétion exNef identifié, un peptide de commande hautement spécifique commode (SMRmut) que nous avons utilisé de se prononcer out protéines co-immunoprécipitées pas spécifiques pour le SMR. Utilisation de un peptide avec des la sdomaine pécifique d'intérêt plutôt que de la protéine full-length nous a permis Pour bypasser le dépistage de des dizaines de facteurs cellulaires qui se lient à d'autres domaines dans Nef ^19.

Une fois que nous avons identifié les partenaires SMR-contraignants, une prochaine étape logique était de montrer que les partenaires de liaison cellulaires identifiés sont important pour la fonction biologique ^18. La procédure standard d'accomplir ceci est à des niveaux de protéines de knockdown à l'aide de miRNA de cible spécifique à la protéine ou siRNA, et par la suite dosage l'effet sur le fonction biologique. Nous avons effectué knockdown de miRNA, qui inhibe la traduction de l'ARNm cible, en réduisant production de que cible, dans ce cas un de protéine SMR-contraignant. Cette réduction de la protéine de cible est un effet indirect, et, éventuellement, a un effet retardé sur la fonction biologique la protéine ciblé joue un rôle po Par conséquent, nous avons également employions le technique moins commun d'inhibition de la anticorps afin de déterminer si perturbant directement l'activité dela protéine cible réduit ou élimine la fonction biologique. Dans cette procédure, les anticorps ont soulevé contre la protéine ciblé sont transfectés dans la cellule en utilisant Chariot Reagent, et interagissent directement avec la protéine cible soit séquestrant il à partir de son site de la fonction, ou le blocage son domaine de liaison pertinente. Inhibition de la protéine de cible à travers cette procédure perturbe directement sa fonction, et peut servir de complément procédures de knockdown d'ARN par confirmant en outre l'importance de la protéine de cible à la fonction biologique.

Alors que Chariot Reagent est efficace à des délivrant peptides et des protéines dans les cellules; ce processus est temps-consommant et limite les types d'expériences, les expositions p. ex prolongée ou répétée et dans les études animales in vivo qui peut être effectuée. Par conséquent, nous avons ajouté un peptide séquence cellule-pénétrante (RPC) à la peptide SMRwt (SMRwt-CPP) ¹⁸ pour générer un peptide qui pourraient être prises up par les cellules passivementà partir de les milieux de culture. Cette version était aussi efficace que l'ancien à inhiber la sécrétion d'exNef.

Les éléments de preuve à partir de ces expériences publiées démontre la capacité des petites peptides contenant des motifs fonctionnelles spécifiques à antagoniser l'fonction de la protéine full-length à travers inhibition compétitive, et pour isoler les protéines qui se lient ces motifs. One s'attendrait à ce que ces techniques devraient être utiles dans de nombreux protocoles expérimentaux. Ils devraient également être efficace dans nouveaux inhibiteurs de peptidiques d'ingénierie de de nombreux processus cellulaires; une fonction qui peut être encore renforcée par une tringlerie à des séquences du RPC.

Protocol

I. Utilisez du film de court Peptides dans Analyse Biological I.1. Mappage des Motifs biologiquement fonctionnel en utilisant des peptides Le traitement des cellules avec peptides de numérisation Nef Appel fait un ensemble de peptides de balayage la région d'intérêt. Pour nos expériences, des peptides 20mer, avec 10 chevauchement d'acides aminés, enjambant l'ensemble du-1 le VIH protéine Nef (205 aa), ont été obtenus à partir de le Reagent Program SIDA….

Representative Results

Cartographie Motifs biologiquement fonctionnels en utilisant des peptides. Deux régions ont été identifiées sur les protéines Nef qui induisent l'apoptose. Apoptose peptide-driven a été observée (Figure 2) en commençant par peptide N50 (aa30-50), avec un pic à N60 (AA40-60) et N70 (AA50-70), et en diminuant les niveaux de fond au peptide N100 (AA80-100). La majeure Motif 1 (M1) de pointe, centrée sur AA50-60, induit> 80% des niveaux apoptotiques de la protéine Nef ple…

Discussion

Comprendre les mécanismes qui sous-tendent la capacité de Nef pour manipuler la voie de la traite des êtres exosomal sera utile dans nouveaux inhibiteurs d'ingénierie de la sécrétion exNef. L'inhibition de la sécrétion exNef devrait diminuer l'épuisement des cellules T CD4 et de la CIA qui pathogenèse dur VIH / SIDA. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé un certain nombre de nouveaux réactifs et de méthodes qui nous ont permis d'analyser la génétique de la sécrétion exNef, e…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
20mer peptide set with 10 amino acid overlap	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	4641
TUNEL Assay	Roche	11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent	Active Motif	30100
Tecan GENEios fluorimeter	(Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate	Corning	3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads	Invitrogen	100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)	Promega Corp., Madison, WI	Z5332
C-18 ZipTip	Millipore	ZTC18S096	C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF	Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF