Peptid-basierte Identifizierung von Functional Motive und ihre Bindungspartner
Summary
Techniken, um die Mechanismen der Sekretion von HIV-1 Nef in exosomes zerlegen beschrieben. Spezifische kurze Peptide von Nef-Protein und Transfektion abgeleitet wurden genutzt, um die Struktur, Funktion und Bindungspartner von Nef die Sekretion Modification Region bestimmen. Diese Verfahren haben allgemeine Bedeutung in vielen mechanistischen Studien.
Abstract
Spezifische kurze Peptide von Motiven in vollständigen Proteine gefunden, in unserem Fall HIV-1 Nef abgeleitet behalten nicht nur ihre biologische Funktion, kann aber auch kompetitiv hemmen die Funktion des Proteins vollständiger Länge. Ein Satz von 20 Nef Abtastung Peptide, 20 Aminosäuren lang mit jeweils überlappenden 10 Aminosäuren seines Nachbarn, wurden verwendet, um Motive in Nef verantwortlich für die Induktion der Apoptose zu identifizieren. Peptide, die diese apoptotischen Motive induziert Apoptose in Mengen vergleichbar mit der Volllängen-Nef-Protein. Ein zweites Peptid, aus dem Sekret Modification Region (SMR) von Nef abgeleitet behielten die Fähigkeit, mit zellulären Proteinen in Nef-Sekretionssystem in exosomes (exNef) beteiligt interagieren. Diese SMRwt Peptid wurde als "Köder"-Protein in Co-Immunopräzipitation Experimenten an zelluläre Proteine, die spezifisch an das Nef SMR Motiv zu isolieren. Protein-und Antikörper-Transfektion Hemmung wurde verwendet, um physisch stören die Interaktion Wetteschen Nef und Mortalin, einer der isolierten SMR-bindende Proteine, und der Effekt wurde mit einem Fluoreszenz-basierte exNef Sekretion-Assay gemessen. Die SMRwt Peptid die Fähigkeit, in voller Länge Nef für zelluläre Proteine, die die SMR Motiv binden outcompete, treffen es die erste Inhibitor des exNef Sekretion. Somit kann durch Verwendung der hier beschriebenen Techniken, die die einzigartigen Eigenschaften von bestimmten kurze Peptide von Motiven in voller Länge Proteinen abgeleitet nutzen, kann eine Beschleunigung der Identifizierung funktioneller Motive in Proteinen und die Entwicklung von Peptid-basierten Inhibitoren von pathogenen Funktionen.
Introduction
Mit dem Aufkommen der antiretroviralen Therapie, hat die AIDS-Epidemie in der westlichen Welt wurde verlangsamt, aber nicht eingeschränkt, und die Ausbreitung von HIV nach wie vor eine große gesundheitliche Belastung auf der ganzen Welt sein. Mit Ausnahme der geringfügig wirksam RV144 Thai-Studie, haben HIV-Impfstoffe bisher fehlende vor Infektionen zu schützen gezeigt. Somit ist die Erforschung zusätzlicher, potentielle therapeutische Targets noch gerechtfertigt.
Zusammen mit CD4 T-Zell-Depletion ist anhaltenden generalisierten Aktivierung des Immunsystems ein Markenzeichen der HIV-Infektion. Diese chronische Aktivierung Immune (CIA) führt in die Zellerneuerung aktiviert und differenziert lymphatischer Subpopulationen zelluläre Seneszenz und Erschöpfung, und die Tötung von T-Zellen und B-Zellen über Aktivierungs-induzierte Zelltod (AICD) 1,2,3 erhöht, und es ist bekannt als einer der stärksten Prädiktoren der Krankheitsprogression 4,5,6,7,8,9,10,11,12 gegründet. Doch die Mechanismen zugrunde CIA und CD4T-Zell-Depletion bei HIV-Infektionen bleiben vollständig aufgeklärt werden.
Evidence aus unserem Labor und andere führte uns zu einem Vorbild für Krankheitsprogression (Abbildung 1), wobei das HIV Protein Nef (Negative Regulatory Factor) induziert die Sekretion in Exosomen von HIV-1-infizierten Zellen 13,14. Diese Nef enthaltenden Exosomen (exNef) Apoptose in einer Anzahl von Zelllinien, einschließlich nicht-infizierten CD4 T-Zellen 15,16. Alternativ kann in Monozyten / Makrophagen exNef ändert Genexpressionsmuster, zB Cytokin-Expression und scheint einen Zustand der Zeitplan Aktivierung des Immunsystems zu induzieren. Dieser Körper des Beweises schlägt eine wichtige Rolle für exNef in CIA und CD4 T-Zell-Depletion.
Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Nef die Fähigkeit zu manipulieren die exosomalen Menschenhandel Weg wird in der Technik neuartige Inhibitoren der exNef Sekretion nützlich. Hemmung der Sekretion exNef sollte vermindern die CD4 T-Zell-DepletionCIA und die Fahrt HIV / AIDS Pathogenese.
Um die Beweise dafür, dass unser Modell für HIV / AIDS Krankheitsverlauf und die nachfolgenden Daten, die auf diesem Modell zu bauen, führte zu sammeln, haben wir eine Reihe neuer Reagenzien und Methoden, die uns die Genetik der exNef Sekretion analysieren erlaubt, und fangen an, die bestimmen, zelluläre Proteine beteiligt. In der ersten Arbeit, fanden wir, dass Nef-Protein Apoptose in Bystander-Zellen induziert und extrazellulär von Nef-transfizierten und HIV-infizierten Zellen freigesetzt 15. Peptide, die von SDF-1α (Stromazellen abgeleiteten Faktor-1, zu alternativem Spleißen alpha) abgeleitet wurde zuvor gezeigt, dass viel von der Bindung und Signalisierung Aktivität des Volllängenmolekül 17 beizubehalten. Wir spekuliert, dass Peptide Nef könnten einige der apoptotischen Aktivität des vollständigen Proteins, und dass diese Peptide zwangsläufig enthalten Nef apoptotischen Domäne (n) zu halten. Um diese Peptide zu identifizieren und damit das Nefapoptotischen Domain (s), erhalten wir eine Reihe von 20 HIV-1 Nef Scannen Peptide aus dem NIH AIDS Forschung und Reference Reagent Programm. Diese 20-aa Peptide, jeweils überlappenden 10 Aminosäuren von seinem Nachbarn, durch die Anzahl ihrer letzten Aminosäure, dh N20 Spannweiten Nef Aminosäuren 1-20, N30 Spannweiten Nef Aminosäuren 11-30, etc 16 benannt. Wir fanden, dass T-Zellen Aussetzen extrazellulär um spezifische Peptide überlappenden zwei verschiedene 10-aa-Domänen in der full-length Nef-Protein induziert Apoptose in diesen Zellen. Eine anschließende Analyse dieser Nef-abgeleiteten Peptide zeigten apoptotische ihre Fähigkeit, physisch mit den Chemokinrezeptor CXCR4 auf der Oberfläche von T-Zellen, mit Bindungskinetik, dass diese Peptide kompetitiv hemmen zwischen CXCR4 und ihre natürlichen Liganden SDF-1α-Bindung erlaubt interagieren. Schließlich wurde das Nef-abgeleiteten Peptide apoptotischen 'Interaktion mit CXCR4 gefunden, um eine Stress-Reaktion in dieser T-Zellen führt zu Apoptose zu induzieren. Diese Beweise konnten wir quickly Karte Nef die funktionellen Domänen, ein Prozess, der viel länger gedauert haben, mit Standard-DNA-Techniken wie erbgutverändernd Alanin-Scanning-Mutagenese. Es zeigte auch, dass diese kurze Nef-abgeleitete Peptide die biologische Funktion der apoptotischen Domänen in dem Protein voller Länge erhalten.
Nach der Identifizierung eine Rolle für extrazelluläre Nef, dh Apoptose von T-Zellen, suchten wir ein besseres Verständnis davon, wie Nef wurde aus Zellen abgesondert. Mittels einer Reihe von mutierten Konstrukte Nef, wir abgebildet hochkonservierten Nef-Protein Motive in den N-terminalen Regionen von sowohl HIV Nef und seine Rhesusaffen entspricht SIV Mac (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, die kritisch für exNef Sekretion 13 sind. Eines dieser Motive, die Sekretion Modification Region (SMR; 66VGFPV70), war besonders kritisch, da Alanin Ersatz eines seiner fünf Aminosäuren entweder stark reduziert oder abgeschafft exNef Sekretion. Wenn die Zellen über Active Motif der C geliefertHariot Protein Lieferung Reagenz, ein Peptid, das die SMR an einem FLAG-Peptid-Sequenz (SMRwt) wurde festgestellt, dass exNef Sekretion sowohl von Nef-transfizierten und HIV-infizierten Zellen 18 hemmen. Basierend auf unseren bisherigen Erfahrungen mit Peptiden, beschlossen wir, dieses Peptid zu verwenden, um die Moleküle und Mechanismen der Nef SMR Rolle in exNef Sekretion aufzuklären.
Mit dem SMRwt Peptid als unsere "Köder-Protein", wir co-immunpräzipitiert zellulären Bindungspartner des SMR von infizierten T-Zell-Lysaten 18. Die FLAG-Peptid-Sequenz bot eine bequeme Handhabe für die Erfassung der SMRwt Peptid mit anti-FLAG Affinitätsharz. Unsere bisherigen Feststellung, dass eine einzige Mutation Valin im SMRwt Peptid Alanin ausreichend für die Abschaffung ihrer Hemmung der Sekretion exNef identifiziert eine komfortable, sehr spezifische Kontrolle Peptid (SMRmut), die wir verwendet, um auszuschließen, Co-immunpräzipitierten Proteine nicht spezifisch für die SMR. Verwendung eines Peptids mit der specific Domäne von Interesse anstatt der Volllängenprotein erlaubt uns, das Screening von Dutzenden von zellulären Faktoren, die zu anderen Domänen in Nef 19 binden zu umgehen.
Sobald wir identifizierten die SMR-Bindungspartner, ein logischer nächster Schritt war es zu zeigen, dass die identifizierten zellulären Bindungspartner wichtig sind für die biologische Funktion 18. Das Standardverfahren dies zu tun ist, um Knockdown Protein-Ebene mit Zielprotein-spezifische miRNA oder siRNA, und anschließend Assay die Auswirkungen auf die biologische Funktion. Wir führten miRNA Knockdown, die Übersetzung der Ziel-mRNA inhibiert, Senkung der Produktionskosten des Ziels, in diesem Fall ein SMR-bindendes Protein. Diese Verringerung des Zielproteins ist eine indirekte Wirkung und gegebenenfalls eine verzögerte Wirkung auf die biologische Funktion des Zielproteins eine Rolle spielt in. Folglich haben wir auch die weniger häufig Antikörper Hemmung Technik eingesetzt werden, um festzustellen, ob direkt durch Stören der Aktivitätdas Zielprotein verringert oder beseitigt die biologische Funktion. In diesem Verfahren erhöht Antikörper gegen das Zielprotein in der Zelle unter Verwendung Chariot Reagenz transfiziert und interagieren direkt mit dem Zielprotein entweder Maskierungsmittel es von seinem Ort der Funktion oder Sperrung der entsprechenden bindenden Domäne. Die Hemmung des Zielproteins durch dieses Verfahren direkt stört ihre Funktion und kann RNA Knockdown Verfahren durch weitere Bestätigung der Bedeutung des Zielproteins an das biologische Funktion ergänzen.
Während Chariot Reagenz ist wirksam bei der Bereitstellung von Peptiden und Proteinen in Zellen, das Verfahren ist zeitraubend und begrenzt die Arten von Experimenten, z. B. längere oder wiederholte Aufnahmen und in vivo Tierversuchen, die durchgeführt werden können. Folglich haben wir einen zellpenetrierendes Peptid (CPP)-Sequenz des Peptids SMRwt (SMRwt-CPP) 18, ein Peptid, das von Zellen aufgenommen könnten passiv zu generierenaus dem Kulturmedium. Diese Version war ebenso wirksam wie bei der Hemmung der ehemaligen exNef Sekretion.
Die Erkenntnisse aus dieser veröffentlichten Versuche demonstriert die Fähigkeit von kleinen Peptiden, die spezifische funktionelle Motive, um die Funktion des Proteins vollständiger Länge durch kompetitive Hemmung antagonisieren, und die Proteine, die diese Motive binden isolieren. Man würde erwarten, dass diese Techniken sollten in vielen experimentellen Protokolle nützlich. Sie sollten auch wirksam in der Technik neue Peptid-Inhibitoren vieler zellulärer Prozesse, eine Funktion, die weiter verbessert werden durch Bindung an CPP-Sequenzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Nef die Fähigkeit zu manipulieren die exosomalen Menschenhandel Weg wird in der Technik neuartige Inhibitoren der exNef Sekretion nützlich. Hemmung der Sekretion exNef sollte vermindern die CD4 T-Zell-Depletion und CIA, die Fahrt HIV / AIDS Pathogenese. Mit diesem Ziel haben wir eine Reihe von neuartigen Reagenzien und Methoden, die uns die Genetik der exNef Sekretion analysieren und damit beginnen, die zelluläre Proteine beteiligt zu bestimmen erlaubt. Dieser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH / NIGMS / MBRS (Zuschuss 58268), NIH / NCRR / RCMI (Zuschuss G12-RR03034), Georgia Research Alliance Finanzierung Zuschuss GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA Zuschuss F31AI091484, Emory CFAR Zuschuss P30 unterstützt A1050409. Diese Untersuchung wurde in einer Anlage mit Unterstützung von Forschungseinrichtungen Improvement Grant # C06 RR18386 von NIH / NCRR konstruiert durchgeführt. Die Jurkat-Zellen, die Menge von 20 HIV-1 Nef Peptide sowie die Kaninchen-Anti-HIV-1 Nef Antiserum aus dem NIH AIDS Research & Reference Reagent Program (Rockville, MD) erhalten.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
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