Radicale a base chimica biomimetica è stato applicato alla costruzione-up librerie necessarie per lo sviluppo di biomarker.
Il coinvolgimento dei radicali liberi nelle scienze della vita è costantemente aumentato con il tempo ed è stato collegato a numerosi processi fisiologici e patologici. Questo tema abbraccia diverse aree scientifiche, che vanno dalla fisica, chimica biologica e bioorganica alla biologia e la medicina, con applicazioni al miglioramento della qualità della vita, la salute e l'invecchiamento. Competenze multidisciplinari sono necessari per la completa indagine delle molteplici sfaccettature dei processi radicali in ambito biologico e chimico conoscenza svolge un ruolo cruciale nello svelare i processi ei meccanismi di base. Abbiamo sviluppato un approccio di biologia chimica in grado di connettersi gratuitamente reattività radicale chimica con i processi biologici, fornendo informazioni sui percorsi meccanici e prodotti. Il nucleo di questo approccio è la progettazione di modelli biomimetici per studiare il comportamento biomolecola (lipidi, acidi nucleici e proteine) in sistemi acquosi, ottenendo intuizioni della reazione percorsi nonché unas costruire librerie molecolari dei prodotti di reazione radicali liberi. Questo contesto può essere usato con successo per il rilevamento e biomarker esempi sono forniti con due classi di composti: mono-trans isomeri di esteri del colesterolo, che sono sintetizzati e utilizzati come riferimenti per il rilevamento in plasma umano, e purine 5 ',8-ciclo-2 '-deoxyribonucleosides, preparati e utilizzati come riferimento nel protocollo per il rilevamento di tali lesioni in campioni di DNA, dopo radiazioni ionizzanti o ottenuti da diverse condizioni di salute.
La reattività dei radicali liberi rivelato la sua enorme importanza per molti eventi biologici, inclusi anziani e l'infiammazione. Oggigiorno è sempre più evidente che la chiarificazione di ogni fase chimici coinvolti in questa reattività è necessario, al fine di comprendere i meccanismi e le strategie prevedono efficaci per il controllo dei radicali liberi e di riparazione del danno. Il contributo studi chimici è fondamentale, ma lo studio diretto nell'ambiente biologico può essere difficile, in quanto la sovrapposizione di diversi processi complica e perturba l'esame dei risultati e delle relative conclusioni. Di conseguenza, la strategia di modellare reazioni dei radicali liberi in condizioni biologicamente connessi è diventato un passo fondamentale nella ricerca di meccanismi chimici in biologia.
Negli ultimi dieci anni il nostro gruppo ha sviluppato modelli di processi senza radicali in condizioni biomimetiche. In particolare endal viso trasformazioni biologicamente rilevanti di acidi grassi insaturi, nucleosidi, e aminoacidi contenenti zolfo e metterli in pista per essere valutati e validati come biomarker dello stato di salute. 1-4
Il nostro approccio generale si compone di tre moduli:
Abbiamo scelto due classi di biomarcatori rilevanti per accreditare questo approccio: esteri del colesterolo e purine 5 ',8-ciclo-2'-deoxyribonucleosides.
La conversione di natura cis acidi grassi insaturi a trans isomeri geometrici è una trasformazione connessa con la produzione di stress radicalico nell'ambiente biologico. Lipidi di membrana delle cellule, che contengono acidi grassi, sono un obiettivo rilevante biologico per stress radicalico e abbiamo prima studiato il endogeno cis-trans isomerizzazione fosfolipidi in colture cellulari, animali ed esseri umani valutando protocolli analitici in ogni caso. 8-10 Abbiamo dimostrato che questa trasformazione può avvenire da una varietà di composti contenenti S, incluse tioli, tioeteri e disolfuri, che in diverse condizioni di stress radicali sono in grado di generare radicali thiyl, cioè l'agente isomerizzante (Figura 3). L'esempio illustrato in questo articolo si concentra sulla classe di esteri del colesterolo, che rappresentano un noto frazione di lipidi plasmatici, strettamente coinvolto nel metabolismo delle lipoproteine. Il legame estere tra acidi grassi e cholesterol è biosynthesized dal trasferimento di acidi grassi dalla posizione 2 della frazione di glicerolo di fosfatidilcolina di colesterolo, un passo catalizzata dalla acile enzima colesterolo lecitina transferasi (LCAT). Pertanto, plasma esteri del colesterolo sono strettamente connesse con fatturato membrana di lipidi, e contengono percentuali piuttosto elevate di acidi grassi polinsaturi (PUFA) tipicamente presenti in fosfatidilcoline, linoleico e acidi arachidonico cioè. Formazione lipoproteina è coinvolto in malattie cardiovascolari e metaboliche. La reattività di esteri del colesterolo naturali con radicali liberi possono verificarsi i doppi legami di linoleato e residui arachidonico, che possono essere trasformati nei corrispondenti isomeri trans geometrici (vedi Figura 1 per le strutture). Caratterizzazione del contenuto di trans esteri del colesterolo nei campioni biologici è interessante per lo sviluppo di biomarker. Una metodologia indiretta consiste nella trasformazione di cholesteryesteri l isolato dal plasma ai corrispondenti esteri di acidi grassi (FAME metile) e la separazione mediante protocolli gascromatografiche. In questo caso, la calibrazione dei riferimenti standard di cis e trans esteri metilici degli acidi viene eseguita, per consentire la quantificazione del contenuto di trans nei campioni. Sulla base degli studi analitici effettuati sulla libreria esteri del colesterolo, si propone di applicare anche un metodo basato sulla spettroscopia Raman, che può essere effettuata direttamente sulla frazione esteri del colesterolo isolata da plasma, senza ulteriore derivatizzazione al FAME corrispondente (vedi figure 2 e 9). Vale la pena notare che fino ad ora non sono descritti metodi efficaci per cis separato e isomeri trans di acidi grassi contenenti lipidi mediante HPLC, come invece descritto da idroperossidi esteri del colesterolo. Finora, il metodo indiretto gascromatografico è ancora il metodo migliore finora disponibili. Con questo metodo il primo quantitativo valuzione del mono-trans contenuti derivati da esteri del colesterolo isolate dal plasma di soggetti sani è stato fornito. Utilizzo Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) il limite di rilevabilità è soddisfacente (ppb) e quantità nanomolari dei composti sono stati rilevati. 5. Con i sistemi di rilevazione diverse questo limite può essere anche abbassato. L'effetto delle radiazioni ionizzanti sulla esteri del colesterolo è questione di ulteriori studi, se una risposta lineare si ottiene rispetto alla dose applicata.
Come secondo esempio, abbiamo scelto nucleosidi modificati che possono essere prodotti da danni dei radicali liberi del DNA. Radicali idrossilici (HO •) sono noti per essere la specie più nocive reattive dell'ossigeno (ROS) per la loro capacità di causare modificazioni chimiche di DNA. Lesioni singole o multiple possono verificarsi su DNA, che in cellule eucariotiche si trova nel nucleo e mitocondri. Identificazione e misura delle principali classi di danni ossidativi al DNA generati richiedere la appropriate librerie molecolari, al fine di impostare i protocolli analitici. Abbiamo focalizzato il nostro interesse sulle lesioni più piccole tandem, che sono purine 5 ',8-ciclo-2'-deoxyribonucleosides, avente un legame covalente ulteriore tra la base e le frazioni di zucchero creati dall'attacco dei radicali liberi. I composti sono 5 ',8-ciclo-2'-deossiadenosina e 5 ',8-ciclo-2'-deossiguanosina esistente nelle 5'R e 5'S forme diastereomeriche (Figura 5). Il loro potenziale per diventare liberi marcatore stress radicalico è materia di ricerca fondamentale. 2 Infatti, quando il DNA è esposto a HO • astrazione radicale idrogeno dalla posizione C5 'dello zucchero è uno dei possibili eventi che portano alla formazione di queste lesioni tandem. Purine 5 ',8-cyclonucleosides può essere misurata come somma di diastereomeri da HPLC-MS/MS digeriti enzimaticamente in γ-irradiati campioni di DNA variabili 1-12 lesioni / 10 6 / nucleosidi Gy andando assenza forma di ossigeno a livello fisiologico di ossigeno Iotessuti n, il rapporto diastereomerico 5'R / 5'S essendo ~ ~ 4 e 3 per 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdGuo, rispettivamente (Figura 11). 11 Si noti che la relazione tra dose di radiazioni e 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdAdo lesioni rilevate nel DNA cellulare è lungi dall'essere compreso. Il singolo esperimento sulla base dell'irradiazione 2kGy riportati nella sperimentale non possono essere considerati conclusivi. 11 Ulteriori esperimenti di questo tipo e quantificazione analitica delle quattro lesioni sono necessari per definire tale rapporto. Il rilevamento di queste lesioni e le trasformazioni più popolari ossidativi (come 8-oxo-2'-deossiguanosina, 8-oxodGuo) sono materia di intense evidenziando l'importanza di entrambe le lesioni durante il metabolismo ossidativo. 6,13 L'utilizzo di HPLC -MS/MS (triplo quadrupolo) ha un limite di rivelazione assieme a 30fmol per tutte e quattro le lesioni. Ultimi miglioramenti sono richiesti per raggiungere limiti di rilevazione dei livelli attomol dallo strumento produttoritori. Sulla base della letteratura molto recente, 6 procedure analitiche dover includere la pulizia corretta del campione e di arricchimento per soddisfare i limiti di rivelazione del MS / MS / MS (ion trap) o del MS / MS (triplo quadrupolo) utilizzati nel nostro caso.
Procedure di sintesi bio-ispirati di composti 1-4 sono stati sviluppati a partire da 8-bromopurine strumenti derivati di cui o fotolisi. 7,12 Queste procedure comportano una reazione radicalica a cascata che imita il meccanismo di danno al DNA di formazione di 5 ',8-cdAdo e 5' ,8-cdGuo lesioni. Da prospettive biologiche, è stato trovato che queste lesioni si accumulano con l'invecchiamento in un tessuto-specifica (fegato> rene cervello>), dimostrando che i meccanismi di riparazione del DNA sono inadeguati per conservare il materiale genetico di queste lesioni. 13 Infatti, nucleotide excision repair (NER) è l'unica via attualmente individuate per la riparazione di queste lesioni. 2
I due classees di composti mostrato nelle figure 1 e 5 non sono commercialmente disponibili al momento, tuttavia dalle strategie sintetiche descritte in letteratura non sarebbe difficile preparare questi composti per uso commerciale.
L'approccio multidisciplinare è fornito da studi di biologia chimica non solo ha un valore enorme per l'identificazione di nuovi meccanismi che si verificano in ambiente biologico, ma dà anche un contributo fondamentale alla scoperta di biomarcatori e la diagnostica, in ultima analisi, portare novità nella cura della salute e le strategie di prevenzione. 14 Il contributo chimica è necessaria per uno sviluppo positivo della medicina molecolare, la creazione di piattaforme integrate e pannelli per profili metabolici che si prevede di consentire una razionalizzazione ottimale di progettazione dell'intervento, sia terapeutico e nutrizionale, riducendo le incertezze e gli errori quando possono essere prevedibili.
The authors have nothing to disclose.
Il sostegno finanziario del Ministero dell'Istruzione, dell'Università della Ricerca (PRIN-2009K3RH7N_002) e Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298555), nonché il patrocinio del COST Action CM0603 su 'Free Radicals in Chemical Biology e azione COST CM1201 su "Chimica Biomimetic radicale" Si ringraziano.
MATERIALS | |||
Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
8-Bromo-2′-deoxyguanosine | Berry & Associates | PR3290-1 g | |
8-Bromo-2′-deoxyadenosine | Berry & Associates | PR3300-1 g | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
2′-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
2′-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
EQUIPMENT | |||
60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 |