Radical-baserade biomimetisk kemi har tillämpats på uppbyggnad bibliotek som är nödvändiga för biomarkör utveckling.
Medverkan av fria radikaler i biovetenskap har ständigt ökat med tiden och har anslutits till flera fysiologiska och patologiska processer. Detta ämne omfattar olika vetenskapliga områden, som spänner från fysiska, biologiska och bioorganisk kemi till biologi och medicin, med ansökningar till förbättring av livskvaliteten, hälsa och åldrande. Tvärvetenskapliga färdigheter krävs för fullständig utredning av de många aspekter av radikala processer i den biologiska miljön och kemiska kunskaper spelar en avgörande roll i att avslöja de grundläggande processer och mekanismer. Vi utvecklade en metod kemisk biologi kunna ansluta fria radikaler kemisk reaktivitet med biologiska processer och ger information om de mekanistiska vägar och produkter. Kärnan i denna strategi är utformningen av biomimetiska modeller för att studera biomolekyler beteende (lipider, nukleinsyror och proteiner) i vattenbaserade system, få insikter av reaktionen vägar samt ens bygga upp molekylära bibliotek av de fria radikal-reaktionsprodukterna. Detta sammanhang kan med framgång användas för biomarkörer och exempel är försedda med två klasser av föreningar: mono-transisomerer av kolesterylestrar, vilka syntetiseras och används som referenser för detektion i human plasma, och purin 5 ',8-cyklo-2 "-deoxiribonukleosider, och användes som referens i protokollet för detektion av sådana skador i DNA-prover, efter joniserande strålning eller erhållas från olika hygienkrav.
Reaktiviteten av fria radikaler avslöjade sin enorma betydelse för många biologiska händelser, inklusive åldrande och inflammation. Numera är det mer och mer uppenbart att klargöra varje kemisk steg inblandade i denna reaktivitet behövs för att förstå de bakomliggande mekanismerna och planerar effektiva strategier för kontroll av fria radikaler och reparation av skadan. Bidraget från kemiska studier är grundläggande, men direkta studier i den biologiska miljön kan vara svårt, eftersom överlagring av olika processer komplicerar och stör granskning av resultaten och tillhörande slutsatser. Därför har strategin att modellera fria radikalreaktioner enligt biologiskt relaterade tillstånd blivit ett grundläggande steg i forskningen om kemiska mekanismer i biologi.
Under det senaste decenniet vår grupp utvecklat modeller av fria radikaler processer under biomimetiska förhållanden. I synnerhet vi envisaged biologiskt relevanta förändringar av omättade fettsyror, nukleosider och svavelhaltiga aminosyror och lägg dem i spåret som ska utvärderas och valideras som biomarkörer för hälsotillståndet. 1-4
Vår allmänna inställning består av tre moduler:
Vi valde två klasser av relevanta biomarkörer att ackreditera denna strategi: kolesterylestrar och purin 5 ',8-cyklo-2'-deoxiribonukleosider.
Omvandlingen av naturligt förekommande cis omättade fettsyror till geometriska trans-isomerer är en transformation i samband med produktionen av radikala stress i den biologiska miljön. Cell membranlipider, som innehåller fettsyror, är en relevant biologiskt mål för radikal stress och vi först studerat endogena cis-trans isomerisering fosfolipider i cellkulturer, djur och människor bedöma analytiska protokoll i varje fall. 8-10 Vi visade att denna omvandling kan ske genom en mängd av S-innehållande föreningar, inkluderande tioler, tioetrar och disulfider, som under olika radikala stressförhållanden har möjlighet att generera thiyl radikaler, dvs isomerisering medlet (figur 3). Exemplet som visas i denna artikel fokuserar på klassen av kolesterylestrar, vilka representerar en välkänd fraktion av plasmalipider, strikt involverade i lipoproteinmetabolism. Esterbindningen mellan fettsyror och cholesterol biosyntetiseras genom överföring av fettsyror från läget 2 i glyceroldelen av fosfatidylkolin till kolesterol, ett steg katalyseras av enzymet lecitin kolesterol acyltransferas (LCAT). Därför plasma kolesterylestrar strikt samband med membranlipid omsättning, och innehåller relativt höga proportioner av de fleromättade fettsyror (PUFA) typiskt närvarande i fosfatidylkoliner, dvs linolsyra och arakidonsyra syror. Lipoprotein bildas är involverat i kardiovaskulära och metabola sjukdomar. Reaktiviteten av naturliga kolesterylestrar med fria radikaler kan uppstå vid dubbelbindningar i linoleat och arakidonat rester som kan omvandlas i motsvarande trans geometriska isomerer (se figur 1 för strukturerna). Karakterisering av det transeuropeiska kolesterylester innehåll i biologiska prover är intressant för biomarkör utveckling. En indirekt metod består av omvandlingen av cholesteryl estrar isolerats från plasma till motsvarande fettsyrametylestrar (FAME) och separation genom protokoll gaskromatografiska. I detta fall, är kalibreringen av de standardverk av cis-och trans-fettsyra-metylestrar utförs, i syfte att möjliggöra kvantifiering av trans-halten i proverna. Baserat på de analytiska studier som utförts på kolesterylester-biblioteket föreslog vi att gälla även en metod baserad på Ramanspektroskopi, som kan utföras direkt på kolesterylester fraktionen isolerad från plasma, utan ytterligare derivatisering till motsvarande FAME (se figur 2 och 9). Det är värt att notera att upp nu inga framgångsrika metoder beskrivs för att separera cis-och trans-isomerer av fettsyror innehållande lipider med HPLC, som istället beskrivs av kolesterylester hydroperoxider. Hittills är den indirekta gaskromatografiska metoden fortfarande den bästa tillgängliga metoden hittills. Genom denna metod den första kvantitativa utvärdering av mono-trans-innehåll som härrör från kolesterylestrar isolerade från plasma från friska försökspersoner tillhandahölls. Använda Detector flamjonisering (FID) gränsen för detekterbarhet är tillfredsställande (ppb) och nanomolära mängder av föreningarna har upptäckts. 5. Med olika detektionssystem denna gräns kan även sänkas. Effekten av joniserande strålning på kolesterylestrar är fråga om ytterligare studier, om ett linjärt svar erhålles i förhållande till den applicerade dosen.
Som ett andra exempel har vi valt modifierade nukleosider vilka kan framställas genom fri radikal skada av DNA. Hydroxylradikaler (HO •) är kända för att vara de mest skadliga reaktiva syreradikaler (ROS) för deras förmåga att orsaka kemiska modifieringar till DNA. Enkla eller multipla lesioner kan förekomma på DNA, att i eukaryota celler är beläget i kärnan och mitokondrier. Identifiering och mätning av de viktigaste klasserna av oxidativa genererade skador till DNA kräver approprIate molekylära bibliotek i syfte att upprätta de analytiska protokoll. Vi fokuserade vårt intresse på de minsta tandem lesioner, vilka är purin 5 ',8-cyklo-2'-deoxiribonukleosider, har en ytterligare kovalent bindning mellan basen och sockerdelar som skapas av den fria radikalen attacken. Föreningarna är 5 ',8-cyklo-2'-deoxiadenosin och 5 ',8-cyklo-2'-deoxiguanosin existerar i 5'R och 5'S diastereomera former (Figur 5). Deras potential att bli fri radikal stressen markör är fråga om grundforskning. 2 Det är när DNA utsätts för HO • radikala väte abstraktion från C5 ställning för sockret en av de möjliga händelser som ledde till bildandet av dessa tandem skador. Purin 5 ',8-cyclonucleosides kan mätas som summan av diastereomerer genom HPLC-MS/MS i enzymatiskt spjälkade γ-bestrålade DNA-prover varierar från 1 till 12 lesioner / 10 6 nukleosider / Gy går formen frånvaro av syre till fysiologisk nivå av syre Jagn vävnader, den diastereomera förhållandet 5'R / 5 är att vara ~ 4 och ~ 3 för 5 ',8-cdAdo och 5' ,8-cdGuo respektive (figur 11). 11 Det är värt att notera att förhållandet mellan stråldos och 5 ',8-cdAdo och 5' ,8-cdAdo lesioner upptäcktes i cellulär DNA är långt ifrån klarlagda. Den enda experiment bygger på 2kGy bestrålning rapporterats i den experimentella kan inte anses avgörande. 11 Ytterligare experiment av detta slag och analytiska kvantifiering av de fyra lesioner är nödvändiga för att definiera en sådan relation. Detekteringen av dessa lesioner och de mer populära oxidativa omvandlingar (såsom 8-oxo-2'-deoxiguanosin, 8-oxodGuo) är fråga om intensiva undersökningar, som visar att betydelsen av båda lesioner under oxidativ metabolism. 6,13 Användningen av HPLC -MS/MS (trippelkvadrupolmasspektrometer) har en detektionsgräns nära 30fmol för alla fyra lesioner. Sista förbättringar påstås nå detektionsgränser attomol nivåer av instrumentet produCER. Baserat på den allra senaste litteraturen, 6 analysmetoder måste innehålla rätt sanering av provet och anrikning i syfte att möta detektionsgränser MS / MS / MS (jonfälla) eller MS / MS användes (trippelkvadrupolmasspektrometer) i vårt fall.
Bio-inspirerade syntetiska förfaranden av föreningar 1-4 utvecklades utgående från 8-bromopurine derivat enligt eller fotolys. 7,12 Dessa förfaranden inbegriper en radikal kaskadreaktion som härmar mekanismen DNA-skada av bildning av 5 ',8-cdAdo och 5' ,8-cdGuo lesioner. Från biologiska perspektiv, visade det sig att dessa skador ackumuleras med åldrande i ett vävnadsspecifikt sätt (lever> njure> hjärna), som styrker att DNA-reparation mekanismer är otillräckliga för att bevara det genetiska materialet från dessa skador. 13 Faktum nukleotid excision reparation (NER) är den enda vägen identifierade för närvarande för reparation av dessa lesioner. 2
De två Klassenes av föreningar som visas i figurerna 1 och 5 är inte kommersiellt tillgängliga för närvarande, men de syntetiska strategierna som beskrivs i litteraturen är det inte skulle vara svårt att framställa dessa föreningar för kommersiellt bruk.
Den tvärvetenskapliga angreppssätt från kemisk biologi studier har inte bara ett enormt värde i att identifiera nya mekanismer som förekommer i den biologiska miljön, men också ger ett grundläggande bidrag till biomarkörer och diagnostik, slutligen föra nyhet i vård och förebyggande strategier. 14 Den kemisk bidrag behövs för en framgångsrik utveckling av molekylär medicin, skapa integrerade plattformar och paneler för metabolisk profilering som förväntas möjliggöra en optimal rationalisering av insatser utformning, antingen terapeutiska och näringsmässiga, minska osäkerheten och misslyckanden när de kan vara förutsägbar.
The authors have nothing to disclose.
Ekonomiskt stöd från Ministero dell'Istruzione, dell'Universita della Ricerca (prin-2009K3RH7N_002) och Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298.555) samt sponsring av COST Action CM0603 om "fria radikaler i kemisk biologi och COST Action CM1201 om "Biomimetic Radical Chemistry" tas tacksamt erkänt.
MATERIALS | |||
Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
8-Bromo-2′-deoxyguanosine | Berry & Associates | PR3290-1 g | |
8-Bromo-2′-deoxyadenosine | Berry & Associates | PR3300-1 g | |
Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
2′-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
2′-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
EQUIPMENT | |||
60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 |