Isolamento, processamento e análise de células gengivais murino
Summary
Este estudo descreve uma técnica eficiente para isolar e processar tecido gengival da cavidade oral do rato de modo a produzir uma cultura de uma única célula. As células resultantes podem ser ainda utilizado para a análise de citometria de fluxo e os estudos moleculares.
Abstract
Desenvolvemos uma técnica para isolar e processar o tecido gengival murino por citometria de fluxo, os estudos moleculares e com precisão. A gengiva é um tecido único e importante para estudar os mecanismos imunitários, porque está envolvido na resposta imune do hospedeiro contra o biofilme oral, que podem provocar doenças periodontais. Além disso, a proximidade da gengiva para o tecido do osso alveolar também permite estudar a remodelação óssea em condições inflamatórias. Nosso método produz grande quantidade de células do sistema imunológico que permite a análise de até populações raras células, tais como células de Langerhans e células T reguladoras como demonstramos anteriormente 1. Empregando ratinhos para estudar as respostas imunitárias locais envolvidos na perda de osso alveolar durante as doenças periodontais, é vantajoso, devido à disponibilidade de várias ferramentas imunológicas e experimental. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho e ao acesso relativamente inconveniente para a gengiva murino, muitos estudos evitada exame de this tecidos críticos. O método descrito neste trabalho podem facilitar a análise de gengiva, que poderá aumentar a atenuante no sistema imunitário por via oral e o seu papel durante as doenças periodontais.
Introduction
Gengiva é o tecido macio em torno da porção cervical dos dentes e cobre o processo alveolar (Figura 1). A gengiva é um tipo de mucosa mastigatória que podem ser ainda separadas no epitélio da mucosa e do tecido conjuntivo (também conhecido como submucosa ou lâmina). A estrutura anatômica da gengiva e dentes adjacentes permite que as bactérias para residir e desenvolver placa (biofilme) que desafia constantemente o sistema imunológico local. Como resultado, a resposta inflamatória desenvolve na gengiva, o que, em determinadas circunstâncias torna-se destrutiva – uma situação designada por doenças periodontais 2. Basicamente, patologias periodontais placa induzidos podem ser divididos em gengivite e periodontite. Gengivite representa uma condição reversível da resposta inflamatória local que está confinada ao gengiva. A periodontite, por outro lado, é um processo de destruição irreversível em que o aparelho de fixação (osso alveolar, periodontalligamento, cemento e gengiva) é destruído 3.
A gengiva foi proposto para servir tanto locais como efectoras e indutivo durante quatro doenças periodontais. Estudos em humanos têm sugerido que, em resposta a placa dental, células efetoras imunes e as moléculas se infiltrado ou partida da gengiva 5-7 dinamicamente. Esta actividade foi demonstrado desempenhar um papel importante na destruição periodontal 8,9. Considerando que os dados gerados por esses estudos forneceram informações valiosas sobre esse processo patológico, trabalhando com os tecidos humanos possuem grandes limitações éticas, técnicas e experimental. O desenvolvimento de modelos experimentais permitiram experimentações de causa-efeito via empregando camundongos transgênicos e intervenções vivo 10. Como resultado, o nosso conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na doença periodontal aumentaram consideravelmente durante as últimas duas décadas. Ainda assim, devido à complexidade da doença periodontal, não existeum debate em curso sobre a natureza da resposta imune local facilitando a destruição dos tecidos. Há também uma falta de compreensão sobre a função das células imunitárias centrais na gengiva durante as doenças periodontais. É, portanto, essencial para estudar eventos inflamatórios patológicos que ocorrem no tecido alvo da doença da gengiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tecidos gengivais Maxilla obtidos a partir de um único rato são suficientes para análise de sub-populações de linfócitos T e B, bem como a sua capacidade para expressar moléculas extracelulares e intracelulares, como previamente descrito 1. No entanto, se as populações de células raras são de interesse (por exemplo, DCs), recomenda-se a tecidos de piscina 2-3 ratinhos. De nota, se preferível, é possível descascar ambos os tecidos gengivais e palatal e, depois, para extirpar a gengiva (uma modifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por doações da Fundação para a Ciência Israel (n º 1418/11) para AHH e (n º 1933/12) para AW, a Fundação israelense alemão para jovens investigadores (GIF jovem) para AHH, eo Dr. I . Fundo Cabakoff Research Endowment da Universidade Hadassah-Faculdade de Medicina Dentária de AHH e AW hebraico.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
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