Analyse af målrettet Viral Protein Nanopartikler Leveret til HER2 + tumorer

Summary

Denne artikel beskriver de procedurer for optisk billeddannelse analyse af tumor målrettede nanopartikel, HerDox. Især detaljeret brug af multimode imaging enhed til detektering tumormålretning og vurdere tumor penetration beskrevet her.

Abstract

HER2 + tumor målrettet nanopartikel, HerDox udviser tumor-præferentiel ophobning og tumor-vækst ablation i en dyremodel af HER2 + kræft. HerDox dannes ved ikke-kovalent selvsamling af en tumor målrettet cellepenetration protein med kemoterapimidlet, doxorubicin, via en lille nukleinsyre-linker. En kombination af elektrofilt, intercalation, og oligomeriserende interaktioner letter selvsamling til runde 10-20 nm-partikler. HerDox udviser stabilitet i blod samt i forlænget opbevaring ved forskellige temperaturer. Systemisk levering af HerDox i tumorbærende mus resulterer i tumor-celledød med ingen påviselige skadelige virkninger på ikke-tumorvæv, herunder hjertet og leveren (som undergår markeret skader ved målrettede doxorubicin). HER2 elevation letter målretning til celler, der udtrykker den humane epidermale vækstfaktor receptor, hvorfor tumorer, der udviser forhøjede HER2 niveauer udviser større akkumulering af HerDox sammenlignet med celler expressynge lavere niveauer, både in vitro og in vivo. Fluorescensintensitet billeddannelse kombineret med in situ konfokal og spektralanalyse har tilladt os at kontrollere in vivo tumor målretning og tumorcelle penetration af HerDox efter systemisk levering. Her har vi detalje vores metoder til vurdering tumormålretning via multimode imaging efter systemisk levering.

Introduction

Tumor-målretning af kemoterapi har potentiale til at eliminere cancerceller ved lavere dosis sammenlignet med ikke-målrettede lægemidler, fordi mere af den leverede terapi kan akkumulere til bestemmelsesstedet i stedet distribuere til ikke-tumorvæv. Da sidstnævnte situation ville fortynde ud effekten af ​​lægemidlet og derfor kræver højere doser for at være effektive, tumor-targeting har både terapeutiske og sikkerhedsmæssige fordele i forhold til standard ikke-målrettet behandling.

Målretning kemoterapi ved indkapsling i selvsamlede nanopartikler tillader stoffet at forblive kemisk uændret i modsætning til lægemidler, der er kovalent knyttet til målsøgende molekyler. Som sådan binding har potentiale til at ændre aktiviteten af ​​både lægemidlet og målsøgende molekyle, ikke-kovalent samling tillader lægemiddel potens bevares.

Vi har tidligere vist, at de hidtil ukendte tre-komponent, selv-samlet kompleks, HerDox målretter HER2 + tumorer <em> In vivo og fremkalder tumor vækst ablation mens besparende normale væv, herunder hjerte ^1. HerDox er dannet gennem ikke-kovalente interaktioner mellem receptor-bindende celle-penetration protein HerPBK10, og det kemoterapeutiske middel, doxorubicin (Dox), via en lille nukleinsyre-linker. HerPBK10 binder human epidermal vækstfaktor receptor (HER) og udløser receptormedieret endocytose ^2-4, mens endosomale membran penetration opnås gennem inkorporering af adenovirus-afledte Penton basen capsidprotein ^4-6. En positivt ladet domæne på proteinet muliggør nukleinsyrebinding ^{4, 5,} gennem hvilken DNA-interkalerede Dox kan transporteres til målrettet levering. Elektrofile, intercalation, og eventuelt protein oligomeriserende interaktioner lette selvsamling til runde 10-20 nm-partikler, som er stabile i blod og under forlænget opbevaring ved forskellige temperaturer ^1.. Præferentiel målretning til HER2 + tumorceller lettes af det forbedrede ligandaffinitet når HER2 er forhøjet.

Vore tidligere studier har vist, at systemisk levering af HerDox udbytter præferentiel akkumulering i tumorer end ikke-tumorvæv og i sammenligning med irrelevante Dox ^1, og indtrængen i tumorceller in vivo ^7.. Vi har observeret, at HerDox frigiver Dox efter tumorcelle indgang, så Dox akkumulering ind i kernen ^1. Tumor-akkumulation synes at korrelere med receptor-niveau, som relativt lave HER2-udtrykkende tumorer akkumulerer mindre HerDox sammenlignet med dem med relativt højere HER2 niveau ^1. Endvidere vil en effektiv celledød koncentration udviser en omvendt korrelation med HER2 display på tumorcellelinier udtrykker forskellige celleoverflade HER2 niveau ^1. HerDox udviser en terapeutisk og sikkerhedsmæssige fordele i forhold til ikke-målrettede Dox, som tumordrab forekommer på mere end 10 gange lavere dosis sammenlignet med untartet lægemiddel og giver ingen påviselig negativ virkning på hjertet (detekteret ved ekkokardiografi og histologisk farvning) eller leveren (detekteret ved TUNEL plet) væv, i modsætning til målrettede Dox ^1.. Trods sin afledning fra et viralt capsid protein, udviser HerPBK10 ingen påviselig immunogenicitet ved terapeutisk niveau ^2. Betragtninger eksisterende antistoffer mod hele adenovirus kan genkende HerPBK10, er de ude af stand til at forhindre cell binding ^2..

Tumor volumen målt over tid er en standard metode til vurdering af terapeutiske effekt af målrettede lægemidler, og har været ansat til at vurdere den terapeutiske effekt af HerDox. Supplere denne tilgang med in vivo og ex vivo fluorescensintensitet imaging har givet os mulighed for bedre at vurdere målrette effektivitet ^7.. Vi har specifikt integreret i situ konfokal billeddannelse af udskårne tumorer med spektralanalyse af Dox fluorescens at kontrollere, at HerDox ikket kun akkumuleret på tumorer in vivo, men trængte ind tumorceller og leverede Dox ind i cytoplasmaet og kernen ^7.. Spektralanalyse endvidere muligt for os at skelne Dox fluorescens fra autofluorescens ^7..

Her viser vi nærmere vores tilgang til vurdering HerDox in vivo efter systemisk levering, og vigtigst, for at vurdere målretning gennem multimode billeddiagnostiske metoder og analyser.

Protocol

1.. Systemisk levering In vivo Bland nok HerDox med sterilt saltvand at sidestille 0,2 ml af en 0,004 mg / kg dosis af HerDox per injektion til en 6-8 uger gamle nu / nu mus bærende subkutane bilaterale flank xenotransplantattumorer. Træk forsigtigt HerDox blandingen i en 3/10 cc insulinsprøjte udstyret med en 29G nål, undgå bobler. Anæstesi induceres ved kortvarig isofluran eksponering i en induktion kammer udstyret med en gas skylningssystem (Oxygen strømningshastigheder:…

Representative Results

Figur 1 viser in vivo optisk kamera prototype, der blev bygget med henblik på billedet erhvervelse under flere modaliteter, herunder fluorescens intensitet, spektrale, levetid, 2-foton, intra-vital konfokal og bioluminescens billeddannelse. Desuden giver den afkølede høj følsomme kamera og høj effekt laser linjer indarbejdet i dette system med højere kontrast fluorescens billeder i forhold til kommercielle optiske billeddannende systemer 11, især til in vivo detektion…

Discussion

Dox fluorescens kan påvises in vivo ved hjælp af multimode imager når tumorer er subkutan. Men den terapeutisk effektive dosis af HerDox (0,004 mg / kg) er under detektionsgrænsen efter en enkelt dosis. I modsætning hertil, efter 7 daglige injektioner (1x/day i 7 dage) tumor ophobning og tilbageholdelse af partiklen er tilstrækkelig til at muliggøre visualisering af Dox fluorescens.

Det er kritisk, når man arbejder med Dox eller enhver anden fluorofor til in vivo bi…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2″ Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B