Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren
Summary
Dit artikel beschrijft de procedures voor optische beeldvorming analyse van de tumor-gerichte nanodeeltjes, HerDox. In het bijzonder wordt gebruik van de gedetailleerde multimode beeldvormingsinrichting voor het detecteren en beoordelen van tumor targeting tumorpenetratie beschreven.
Abstract
De HER2 + tumor-gerichte nanodeeltjes, HerDox, vertoont tumor-preferentiële accumulatie en tumor-groei van ablatie in een diermodel van HER2 + kanker. HerDox wordt gevormd door niet-covalente zelfassemblage van een tumor gerichte cel penetratieproteïne het chemotherapeutische middel, doxorubicine, via een kleine nucleïnezuur linker. Een combinatie van elektrofiele, intercalatie, en oligomerization interacties vergemakkelijken zelf-assemblage in ronde 10-20 nm deeltjes. HerDox vertoont stabiliteit in bloed en bij langdurige opslag bij verschillende temperaturen. Systemische levering van HerDox in tumordragende muizen resulteert in tumor celdood zonder waarneembare nadelige effecten op niet-tumorweefsel, waaronder het hart en de lever (die gekenmerkt schade door ongerichte doxorubicine ondergaan). HER2 hoogte vergemakkelijkt richten naar cellen die de humane epidermale groeifactor receptor, waardoor tumoren HER2 tonen verhoogde niveaus vertonen grotere accumulatie van HerDox opzichte cellen expreszing lagere niveaus, zowel in vitro als in vivo. Fluorescentie-intensiteit imaging gecombineerd met in situ confocale en spectrale analyse heeft ons toegestaan om te controleren in vivo tumor targeting en tumorcel penetratie van HerDox na systemische toediening. Hier detail we onze methoden voor de beoordeling tumor targeting via multimode beeldvorming na systemische toediening.
Introduction
Tumor targeting van chemotherapie heeft het potentieel om kankercellen te elimineren bij lagere dosering in vergelijking met getargete drugs omdat meer van de afgegeven therapie kan ophopen op de plaats van bestemming verspreiden naar niet-tumorweefsel. Zoals de laatste situatie zou verwateren uit de werkzaamheid van het geneesmiddel en dus een hogere dosering nodig om effectief te zijn, tumor targeting heeft zowel therapeutische en veiligheid voordelen ten opzichte van standaard niet-gerichte behandeling.
Targeting chemotherapie door inkapseling in zelfassemblerende nanodeeltjes kan het geneesmiddel blijft chemisch gemodificeerd met medicijnen die covalent zijn gekoppeld aan richtmoleculen. Als zodanig koppeling heeft het potentieel om de activiteit van zowel het geneesmiddel en het doel richtend molecuul veranderen, niet-covalente samenstel kan geneesmiddelsterkte te bewaren.
We hebben eerder aangetoond dat de nieuwe drie-component, zelf-geassembleerde complex, HerDox, richt HER2 + tumoren <em> In vivo en lokt tumor-groei ablatie terwijl het sparen van normaal weefsel, met inbegrip van het hart 1. HerDox wordt gevormd door niet-covalente interacties tussen de receptor-bindende cell-penetratie eiwit, HerPBK10, en het chemotherapeutische middel, doxorubicine (Dox), via een kleine nucleïnezuur linker. HerPBK10 bindt de humane epidermale groeifactor receptor (HER) en veroorzaakt receptor-gemedieerde endocytose 2-4, terwijl endosomale membraan penetratie wordt bereikt door incorporatie van het adenovirus-afgeleide penton base capside-eiwit 4-6. Een positief geladen domein op het eiwit kan nucleïnezuurbindende 4, 5, waardoor DNA-geïntercaleerde Dox worden vervoerd gerichte toediening. Elektrofiele, intercalatie, en eventueel eiwit oligomerization interacties vergemakkelijken zelf-assemblage in ronde 10-20 nm deeltjes die stabiel zijn in het bloed en onder langdurige opslag bij verschillende temperaturen 1. Preferentiële richten naar HER2 + tumorcellen wordt vergemakkelijkt door de verhoogde affiniteit ligand als HER2 wordt verhoogd.
Onze vorige studies hebben aangetoond dat systemische toediening van HerDox opbrengsten preferentiële accumulatie in tumoren via niet-tumorweefsel en in vergelijking met ongerichte Dox 1 en penetratie in tumorcellen in vivo 7. We hebben geconstateerd dat HerDox releases Dox na tumorcel binnenkomst, waardoor Dox accumulatie in de kern 1. Tumor-accumulatie lijkt te correleren met receptor-niveau, zoals relatief lage HER2-expressie tumoren accumuleren minder HerDox vergelijking met die met relatief hogere HER2 niveaus 1. Daarnaast draagt de celdood concentratie vertoont een omgekeerde correlatie met HER2 weergave op tumor cellijnen verschillen celoppervlak HER2 niveau 1. HerDox vertoont een therapeutische en veiligheid voordeel ten opzichte van ongerichte Dox, zoals tumor doden optreedt bij meer dan 10-maal lagere dosis in vergelijking met de untarrichte drug en levert geen waarneembare nadelige invloed op het hart (gedetecteerd met echocardiografie en histologische kleuring) of lever (gedetecteerd door TUNEL kleuring) weefsel, in tegenstelling tot irrelevante Dox 1. Ondanks de afleiding van een viraal capside-eiwit, HerPBK10 vertoont geen waarneembare immunogeniciteit bij therapeutische niveaus 2. Dat reeds bestaande antilichamen tegen gehele adenovirus herkent HerPBK10, zij geen celbinding 2 voorkomen.
Tumorvolume gemeten over de tijd is een standaard methode voor het beoordelen van de therapeutische werkzaamheid van gerichte therapieën, en is gebruikt voor de beoordeling van de therapeutische werkzaamheid van HerDox. Aanvulling van deze aanpak met de in vivo en ex vivo fluorescentie-intensiteit beeldvorming heeft ons toegestaan om beter te beoordelen richten efficiency 7. We hebben specifiek geïntegreerd in situ confocale beeldvorming van weggesneden tumoren met spectrale analyse van Dox fluorescentie om dat HerDox niet controlerent alleen opgebouwd op tumoren in vivo maar doorgedrongen in tumorcellen en geleverd Dox in het cytoplasma en de kern 7. Spectrale analyse bovendien konden we Dox fluorescentie onderscheiden van autofluorescence 7.
Hier laten we zien meer in detail onze aanpak voor de beoordeling van HerDox in vivo na systemische toediening, en het belangrijkst, voor het beoordelen van targeting via multimode beeldvormende methoden en analyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dox fluorescentie kan worden detecteerbaar in vivo met behulp van de multimode imager wanneer tumoren zijn onderhuids. De therapeutisch effectieve dosis van HerDox (0.004 mg / kg) onder de detectiegrens na een enkele dosis. Daarentegen na 7 dagelijkse injecties (1x/day gedurende 7 dagen), de tumor accumulatie en retentie van het deeltje is voldoende om visualisatie van Dox fluorescentie mogelijk.
Het is essentieel bij het werken met Dox of andere fluorofoor in vivo be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan LKM-K van de National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 en R01CA140995). Dr Medina-Kauwe bedankt C. Rey, M. M-Kauwe en D. Revetto voor blijvende steun.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2″ Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
References
- Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).
- Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).
- Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).
- Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).
- Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).
- Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7 (4), e34463 (2012).
- Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007 (2011).
- Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. . Biomedical Optical Imaging. , (2009).
- Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
- Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4 (2), e4418 (2009).
- Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).
