Analyse av målrettet Viral Protein Nanopartikler Levert til HER2 + Svulster

Summary

Denne artikkelen detaljer prosedyrer for optisk avbildning analyse av tumor-målrettet nanopartikler, HerDox. Spesielt er detaljert bruk av multimodus bildebehandlingsenhet for detektering av tumor målretting og vurdering av tumor penetrasjon beskrevet her.

Abstract

Den HER2 + tumor-rettet nanopartikler, HerDox, oppviser tumor-preferensiell akkumulering og tumor-vekst ablasjon i en dyremodell av HER2 + kreft. HerDox er dannet av ikke-kovalente egen sammensetning av en svulst målrettet celle penetrasjon protein med kjemoterapi agent, doksorubicin, via en liten nukleinsyre linkeren. En kombinasjon av elektrofil, interkalering, og oligomerisering interaksjoner lette selv-sammenstilling til rundt 10-20 nm partikler. HerDox utviser stabilitet i blod så vel som i utvidet lagring ved forskjellige temperaturer. Systemisk levering av HerDox i tumor-bærende mus resultater i tumor-celledød uten påvisbare negative effekter på ikke-tumor vev, inkludert hjertet og leveren (som gjennomgår merket skade ved vilkårlige doksorubicin). HER2 høyde forenkler rettet til celler som uttrykker human epidermal vekstfaktor reseptor, derav svulster som viser forhøyede HER2 nivåer viser større opphopning av HerDox sammenlignet med celler uttrykksynge lavere nivåer, både in vitro og in vivo. Fluorescensintensitet bildebehandling kombinert med in situ konfokal og spektralanalyse har tillatt oss å bekrefte in vivo tumor målretting og svulst celle penetrasjon av HerDox etter systemisk levering. Her har vi detalj våre metoder for å vurdere svulst målretting via multimode bildebehandling etter systemisk levering.

Introduction

Tumor-målretting av kjemoterapi har potensial til å eliminere kreftceller ved lavere dose i forhold til uønskede stoffer fordi mer av det leverte terapi kan samle på sitt mottakeren i stedet distribuere til ikke-svulstvev. Ettersom den sistnevnte situasjon vil fortynne ut effekten av medikamentet og således kreve høyere doser for å være effektive, har tumor-targeting både terapeutiske og sikkerhet fordeler fremfor standard ikke-målrettet behandling.

Målretting kjemoterapi ved innkapsling i selvkonfeksjonerte nanopartikler gjør at stoffet skal forbli kjemisk uendret i motsetning til legemidler som er kovalent knyttet til målretting molekyler. Som sådan kopling har potensial til å endre aktiviteten av både medikamentet og målretting molekyl, ikke-kovalente montering tillater medikament potens til å bli beholdt.

Vi har tidligere vist at romanen tre-komponent, selv-montert kompleks, HerDox, mål HER2 + tumorer <em> In vivo og utløser tumor-vekst ablasjon mens sparsom normalt vev, inkludert hjertet ^en. HerDox er dannet gjennom ikke-kovalente interaksjoner mellom den reseptor-bindende celle-penetrasjon protein, HerPBK10, og det kjemoterapeutiske middel, doksorubicin (Dox), via en liten nukleinsyre linkeren. HerPBK10 binder human epidermal vekstfaktorreseptor (HER) og utløser reseptormediert endocytose ^2-4, mens endosomale membran penetrasjon oppnås ved hjelp av inkorporering av adenovirus-avledet Penton basen capsidproteinet ^4-6. Et positivt ladet domene på protein muliggjør nukleinsyre ^{4. binding, 5,} gjennom hvilke DNA-interkalerte Dox kan transporteres for målrettet levering. Electrophilic, interkalering, og muligens protein oligomerization interaksjoner rette for selvbygging til runde 10-20 nm partikler som er stabile i blodet og under utvidet lagring ved forskjellige temperaturer ^en. Fortrinnsrett rettet til HER2 + kreftceller er tilrettelagt av den forbedrede ligand affinitet når HER2 er forhøyet.

Våre tidligere undersøkelser har vist at systemisk levering av HerDox utbytter preferensiell akkumulering i tumorer enn ikke-tumorvev og i forhold til ^en ikke-målrettet Dox, og inntrengning i tumorceller in vivo ^7.. Vi har observert at HerDox utgivelser Dox etter svulst celle oppføring, slik at Dox opphopning inn i kjernen ^en. Tumor-opphopning synes å korrelere med receptor nivå, så relativt lave HER2-uttrykke svulster akkumulere mindre HerDox sammenlignet med de med relativt høyere HER2 nivå ^1. Videre viser den effektive celledød konsentrasjon en invers korrelasjon med HER2-skjerm på cellelinjer som uttrykker ulike celleoverflaten HER2 nivå ^1. HerDox viser en terapeutisk og sikkerhet fordel over vilkårlige Dox, som tumor drap skjer på over 10 ganger lavere dose i forhold til untargeted medikament og gir ingen påvisbar skadelig virkning på hjertet (påvist ved ekkokardiografi og histologiske flekk) eller leveren (påvist ved TUNEL flekk) vev, i motsetning til vilkårlige Dox ^1.. Til tross for sin avledning fra en viral capsidproteinet, viser HerPBK10 ingen påviselig immunogenicity ved terapeutiske nivåer ^to. Mens pre-eksisterende antistoffer mot hele adenovirus kan gjenkjenne HerPBK10, er de ikke i stand til å hindre celle binding ^to.

Tumor volum målt over tid er en standard metode for å vurdere terapeutiske effekten av målrettet terapi, og har vært ansatt for å vurdere den terapeutiske effekten av HerDox. Supplere denne tilnærmingen med in vivo og ex vivo fluorescens intensitet imaging har tillatt oss til bedre å vurdere målretting effektivitet ^7. Vi har spesielt integrert i situ confocal avbildning av utskårende svulster med spektral analyse av Dox fluorescens for å bekrefte at HerDox ingent bare akkumulert på svulster in vivo, men trengt inn i tumorceller og levert Dox inn i cytoplasma og cellekjernen ^7. Spektralanalyse dessuten gjort oss i stand til å skille Dox fluorescens fra autofluorescence ^7.

Her viser vi nærmere vår tilnærming for å vurdere HerDox in vivo etter systemisk levering, og viktigst, for å vurdere målretting gjennom multimode imaging metoder og analyser.

Protocol

En. Systemisk levering In vivo Bland nok HerDox med sterilt saltvann for å likestille 0,2 ml av en 0,004 mg / kg dose av HerDox per injeksjon for en 6-8 uker gamle NU / NU mus bærende underhudssykdommer bilaterale flanke xenografttumorer. Forsiktig trekke HerDox blandingen i en 3/10 cc insulin sprøyte med 29g nål, unngå bobler. Anestesi ble indusert ved kort eksponering isofluran i induksjonsovn kammer utstyrt med en gass avsugsystem (oksygen strømningshastigheter: 0,5-1 l /…

Representative Results

Figur 1 viser in vivo optisk imager prototype, som ble bygget for formålet med bildet oppkjøpet under flere modaliteter, inkludert fluorescensintensitet, spektral, levetid, to-foton, intra-vital konfokal, og Bioluminescens bildebehandling. I tillegg gir den avkjølte høy følsom kamera og High Power Laser linjer innlemmet i dette system med høyere kontrast fluorescens bilder sammenlignet med kommersielle optiske avbildningssystemer 11, spesielt for in vivo deteksjon av d…

Discussion

Dox fluorescens kan påvises in vivo med multimode imager når svulster er underhudsfett. Imidlertid er den terapeutisk effektive dose av HerDox (0,004 mg / kg) under deteksjonsgrensen etter en enkelt dose. I kontrast, etter 7 daglige injeksjoner (1x/day i 7 dager), er svulsten akkumulering og retensjon av partikkelen er tilstrekkelig til å muliggjøre visualisering av Dox fluorescens.

Det er kritisk når man arbeider med Dox eller andre fluoroforen for in vivo avbildning …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2″ Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B