Gezielte Analyse von viralen Proteins Nanopartikel HER2 + Tumoren Lieferung
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verfahren für die optische Bildgebung Analyse der Tumor-Targeting-Nanopartikel, HerDox. Insbesondere wird eine detaillierte Verwendung der Multimode-Bildaufnahmevorrichtung zum Erfassen Tumor-Targeting und Bewertung Tumorpenetration beschrieben.
Abstract
Der HER2 + Tumor-Targeting-Nanopartikel, HerDox weist Tumor-und Tumor-Akkumulation bevorzugte Wachstum Ablation in einem Tiermodell der HER2 + Krebs. HerDox durch nichtkovalente Selbstorganisation eines Tumors Zielzelle Penetrationsprotein mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin ausgebildet ist, über eine kleine Nukleinsäure Linker. Eine Kombination von elektrophilen, Einlagerung und Oligomerisierung Interaktionen erleichtern self-assembly in runde 10-20 nm großen Partikeln. HerDox aufweist Stabilität im Blut sowie einer längeren Lagerung bei verschiedenen Temperaturen. Systemische Abgabe HerDox in tumortragenden Mäusen zur Tumor-Zelltod ohne feststellbare nachteilige Auswirkungen auf Nicht-Tumor-Gewebe, einschließlich des Herzens und der Leber (der unterziehen gekennzeichnet Schäden durch ungezielte Doxorubicin). HER2 Höhe erleichtert Targeting von Zellen, die den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor, damit Tumoren Anzeige erhöhten HER2 Ebenen größere Ansammlung von HerDox weisen im Vergleich zu Zellen, Expressionsingen unteren Ebenen, sowohl in vitro als auch in vivo. Fluoreszenzintensität Bildgebung mit in situ konfokalen und Spektralanalyse kombiniert hat uns erlaubt, in vivo Tumor-Targeting und Tumorzelle Eindringen von HerDox nach systemischer Lieferung überprüfen. Hier haben wir ausführlich unsere Methoden zur Beurteilung der Tumor-Targeting über Multimode-Bildgebung nach systemischer Lieferung.
Introduction
Tumor-Targeting der Chemotherapie hat das Potenzial, Krebszellen zu niedrigeren Dosis im Vergleich zu beseitigen ungezielte Drogen, weil mehrere gelieferte Therapie am Bestimmungsort anstatt zu verteilen, um Nicht-Tumorgewebe ansammeln können. Da dieser Situation verdünnen sich die Wirksamkeit des Arzneimittels und somit höhere Dosen wirksam zu sein, hat Tumor-Targeting sowohl therapeutische als auch sicherheitstechnische Vorteile gegenüber herkömmlichen nicht-zielgerichtete Behandlung.
Targeting Chemotherapie durch Verkapselung in selbstorganisierte Nanopartikel ermöglicht das Medikament zu bleiben chemisch im Gegensatz zu Medikamenten, die kovalent an Targeting-Moleküle gebunden sind unverändert. Als solche Verbindung hat das Potential, die Aktivität von sowohl dem Wirkstoff und dem Zielmolekül zu ändern; nichtkovalente Anordnung ermöglicht Arzneistoffwirksamkeit beibehalten werden.
Wir haben bereits gezeigt, dass das neue Drei-Komponenten, self-assembled komplex, HerDox, HER2 + Tumoren zielt <em> In vivo und entlockt Tumor-Wachstum Ablation unter Schonung gesunden Gewebes, einschließlich des Herzens 1. HerDox durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den Rezeptor-Bindungs-Zelle Penetrationsprotein, HerPBK10 und des chemotherapeutischen Mittels gebildet, Doxorubicin (DOX), über eine kleine Nukleinsäure Linker. HerPBK10 bindet den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (HER) und löst Rezeptor-vermittelte Endozytose 2-4, während endosomalen Membran Penetration durch Einbau des Adenovirus-abgeleiteten Pentonbasis Kapsidprotein 4-6 erreicht wird. Eine positiv geladene Domäne des Proteins ermöglicht Nukleinsäurebindung 4, 5, durch die DNA-interkalierten Dox zum gezielten Transport transportiert werden können. Elektrophile, Einlagerung und möglicherweise Protein-Interaktionen erleichtern Oligomerisierung Selbstorganisation zu rund 10-20 nm großen Partikeln, die stabil sind in Blut und unter längerer Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen 1. Bevorzugte Targeting HER2 + Tumorzellen durch die erhöhte Ligandenaffinität erleichtert, wenn HER2 erhöht ist.
Unsere bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass die systemische Verabreichung von HerDox Ausbeuten bevorzugte Anreicherung in Tumoren über Nicht-Tumorgewebe und im Vergleich zu Dox 1 und Eindringen in Tumorzellen ungezielte in vivo 7. Wir haben beobachtet, dass HerDox Veröffentlichungen Dox nach Tumorzelle Eintrag, so dass Dox Akkumulation in den Zellkern ein. Tumor-Akkumulation erscheint mit Rezeptor korrelieren, als relativ gering HER2-positive Tumoren anreichern weniger HerDox Vergleich zu denen mit vergleichsweise höheren HER2 Stufen 1. Darüber hinaus zeigt die effektive Konzentration Zelltod eine inverse Korrelation mit HER2 Anzeige auf Tumor-Zelllinien unterschiedlicher Zelloberfläche HER2-Stufen 1. HerDox zeigt eine therapeutische Sicherheit und Vorteil gegenüber ungezielte Dox, wie Tumorabtötung tritt bei über 10-mal niedriger Dosis im Vergleich zum entpackengeted Wirkstoff und zeigt keine nachweisbare negative Wirkung auf Herz (nachgewiesen durch Echokardiographie und histologische Färbung) oder Leber (nachgewiesen durch TUNEL-Färbung) Gewebe, im Gegensatz zu ungezielte Dox 1. Trotz seiner Herkunft aus einer Virushülle Protein weist HerPBK10 keine nachweisbare Immunogenität im therapeutischen Bereich 2. Während bereits vorhandenen Antikörper zu ganzen Adenovirus HerPBK10 erkennen können, sind sie nicht in der Lage Zellbindung 2 zu verhindern.
Tumorvolumen über die Zeit gemessen wird, eine Standard-Methode zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit einer Therapie erfolgen und ist für die Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit von HerDox eingesetzt. Ergänzend diesen Ansatz mit in vivo und ex vivo Fluoreszenz Bildgebung hat uns erlaubt, besser zu beurteilen Targeting Effizienz 7. Wir haben insbesondere in situ konfokale Abbildung entfernten Tumoren mit Spektralanalyse Dox Fluoreszenz integriert, dass keine Verifizierung HerDoxt nur bei Tumoren in vivo angesammelt aber drang in Tumorzellen und geliefert Dox in das Zytoplasma und Zellkern 7. Spektralanalyse ermöglichte es uns, weiterhin Dox Fluoreszenz von Autofluoreszenz 7 unterscheiden.
Hier zeigen wir näher unser Ansatz für die Beurteilung HerDox in vivo nach systemischer Lieferung, und vor allem für die Beurteilung durch Targeting Multimode bildgebende Verfahren und Analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dox Fluoreszenz in vivo nachweisbar sein mit der Multimode-Imager, wenn Tumoren subkutane sind. Allerdings ist die therapeutisch wirksame Dosis von HerDox (0,004 mg / kg) unterhalb der Nachweisgrenze nach einer Einzeldosis. Im Gegensatz dazu, nach 7 tägliche Injektionen (1x/day für 7 Tage), ist der Tumor Akkumulation und Retention der Partikel ausreicht, um die Visualisierung von Dox Fluoreszenz ermöglichen.
Es ist wichtig bei der Arbeit mit Dox oder einem anderen Fluorophor für…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu LKM-K von den National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 und R01CA140995) finanziert. Dr. Medina-Kauwe dankt C. Rey, M. M-Kauwe und D. Revetto für anhaltende Unterstützung.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fluorescence laser scanning confocal microscope | Leica | SPE | |
| In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging | Multimode In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week | Charles River | Strain code 088 | |
| MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| 3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2″ Ultra-FineIV permanently attached needle | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
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