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Neuroscience

माउस के आनुवंशिक हेरफेर के माध्यम से Hypothalamus का विकास Published: July 24, 2013 doi: 10.3791/50412
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg, 2Institut de recherches cliniques de Montreal
* These authors contributed equally

Summary

हाइपोथेलेमस के कार्यात्मक और चिकित्सा महत्व के बावजूद,

Abstract

विकासशील स्तनधारी मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों के आनुवंशिक संशोधन एक बहुत शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है. हालांकि, उपन्यास माउस म्यूटेंट पैदा अक्सर frustratingly धीमी है. यह उचित बाद operatory अस्तित्व के साथ गर्भाशय में विकसित करने के लिए माउस मस्तिष्क के लिए उपयोग संभव है कि दिखाया गया है. फिर भी, इस प्रक्रिया के परिणाम विकासशील मस्तिष्क का सबसे सतही और आसानी से सुलभ भाग के लिए लगभग विशेष रूप से सूचित किया गया है, प्रांतस्था अर्थात्. चेतक, एक संकरा और अधिक औसत दर्जे का क्षेत्र, लक्ष्य और अधिक कठिन साबित हो गया है. विशेष रूप से गहरी नाभिक, हाइपोथैलेमस के उन लोगों में अभिकर्मक, सबसे चुनौतीपूर्ण और इसलिए बहुत कुछ परिणामों की सूचना दी गई है शायद है. यहाँ हम पूरे हाइपोथैलेमस neuroepithelium या electroporation के माध्यम से अभिकर्मक के लिए इसका हिस्सा (हाइपोथैलेमस) क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन. हमारे दृष्टिकोण के लिए चाबी टी में अब निद्रावहन बार, इंजेक्शन हैंhird निलय, और उचित प्रकार और इलेक्ट्रोड की स्थिति. इसके अतिरिक्त, हम को लक्षित और सबसे धंसे हुए हाइपोथैलेमस नाभिक, mammillary शरीर के बाद ऊतकीय विश्लेषण के परिणाम दिखाते हैं.

Introduction

भ्रूण माउस मस्तिष्क के आनुवंशिक हेरफेर के विकास के विनियमन के बारे में जानने के लिए एक पसंदीदा तरीका है. उत्परिवर्ती माउस लाइनों की पीढ़ी हालांकि धीमी और महंगी है. स्तनधारी मस्तिष्क के न्यूरॉन्स के विकास में विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन शुरू करने के लिए एक शक्तिशाली विधि utero electroporation में है. मूलतः, तकनीक तो भ्रूण, समय की एक निश्चित अवधि के लिए जीवित रहने के दिमाग को इकट्ठा करने और संभव उपन्यास, जानकारीपूर्ण phenotypes के लिए उन्हें जांच के लिए अनुमति देने, बिजली के दालों के माध्यम से भ्रूण के मस्तिष्क neuroepithelium में डीएनए transfecting के होते हैं. इस तरह, प्रयोगकर्ता माउस म्यूटेंट के उत्पादन के लिए आवश्यक लंबी प्रतीक्षा अवधि के बिना लगभग तुरंत परिकल्पना परीक्षण कर सकते हैं.

विकासशील भ्रूण में डीएनए की अभिकर्मक लड़की भ्रूण 1 पर ओवो electroporation में के साथ शुरू कर दिया. माउस के लिए सबूत की अवधारणा आवश्यक संस्कृति में प्रदर्शन किया गया था गर्भ 3,4 में माउस पर तकनीक के पहले वर्णन किया गया.

मुख्य समस्या यह है कि उन्हें या मां की हत्या के बिना गर्भ में भ्रूण के विकास के मस्तिष्क transfect है. (Laparotomy, इंजेक्शन, इलेक्ट्रोपोरेशन) आवश्यक सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए सीखने की एक लंबी अवधि के प्रशिक्षण की आवश्यकता है. सर्जरी भ्रूण अस्तित्व अनुपात स्वीकार्य है इस मुद्दे पर जहां महारत हासिल हो जाने के बाद, अगले महत्वपूर्ण सवाल यह है कि मस्तिष्क संरचना सुलभ कर रहे हैं? आश्चर्य नहीं कि utero electroporation में साथ प्राप्त परिणामों दिखा पहले पत्र प्रकाशित कोर्टिकल विकास 5-9 पर जोर दिया. सर्जिकल प्रक्रियाओं के लिए सबसे सुलभ विकासशील माउस मस्तिष्क के क्षेत्र प्रांतस्था (चित्रा 1) है, क्योंकि यह इस तकनीक का उपयोग प्रकाशनों के अधिकांश के लिए भी सच है. प्रांतस्था में utero electroporation में के लिए प्रक्रिया का वर्णन किया गया हैप्रिंट 10 में और वीडियो 11-14 में. तकनीक का एक संशोधन telencephalon की एक उदर भाग, बेसल ganglia 15 को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Telencephalon परे, diencephalon (प्रतिष्ठित चेतक और हाइपोथेलेमस में विभाजित) तक पहुंचने के लिए और अधिक कठिन अग्रमस्तिष्क का एक क्षेत्र है. इसके पृष्ठीय और सबसे सुलभ हिस्सा, चेतक 16-19 को निशाना कागजात रिपोर्ट की एक छोटी संख्या.

हाइपोथैलेमस, अग्रमस्तिष्क की सबसे उदर हिस्सा है इसलिए एक पृष्ठीय सतह (प्रांतस्था) (चित्रा 1) से सबसे अधिक गहराई स्थानीयकृत. इस क्षेत्र में आनुवंशिक रूप से गर्भाशय में माउस मस्तिष्क में हेरफेर करने के लिए प्रतिबद्ध शोधकर्ताओं के लिए एक कठिन चुनौती बनी हुई है. हमारे ज्ञान करने के लिए, केवल बहुत कुछ लेख माउस हाइपोथेलेमस 20,21 में गर्भाशय अभिकर्मक में के परिणामों पर रिपोर्ट. हालांकि, हाइपोथैलेमस canno के कार्यात्मक महत्वयह, संभोग, प्रजनन और parenting 22 खाने और पीने की तरह व्यवहार को नियंत्रित करता है के बाद से टी, अतिरंजित किया. इसके अलावा, हाइपोथैलेमस विकास में परिवर्तन के बाद मोटापा, उच्च रक्तचाप, मधुमेह और असामयिक यौवन 23 की तरह जीवन स्थितियों में आरंभ करने के लिए योगदान करते हैं. विकास के दौरान आनुवंशिक हाइपोथेलेमस को बदलने में सक्षम होने के नाते इसे समझने के लिए एक बहुत शक्तिशाली उपकरण प्रदान करेगा.

हम यहाँ का उपयोग करें कि गर्भवती चूहों के laparotomy के लिए बुनियादी शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल अन्य प्रोटोकॉल 11,13,14,24 में प्रयुक्त के समान है. हम पूर्णता के लिए संक्षेप में उन्हें यहाँ का वर्णन करेंगे. हमारी प्रक्रिया की कुंजी, दूसरे हाथ पर, संज्ञाहरण के प्रकार, इंजेक्शन की जगह, इलेक्ट्रोड के प्रकार और सम्मिलन और भ्रूण के सिर के संबंध में सकारात्मक इलेक्ट्रोड की स्थिति में हैं. पूर्व के लिए अनुमति देता है के बाद से हम साधारण intraperitoneal संज्ञाहरण से अधिक गैस साँस लेना के माध्यम से संज्ञाहरण प्रेरित करने और बनाए रखने के लिए पसंद करते हैंनिद्रावहन की कुछ हद तक लंबी अवधि के लिए एक मुश्किल सर्जरी के लिए आवश्यक है. संज्ञाहरण से तेजी से वसूली में isoflurane साँस लेना परिणाम, आमतौर पर माँ पहले से ही सर्जरी के बाद मिनट के सामान्य व्यवहार को दर्शाता है. कांच micropipette के साथ डीएनए समाधान के इंजेक्शन के लिए सबसे आसान बिंदु हालांकि हाइपोथेलेमस electroporation के लिए पूरी तरह से अनुपयुक्त है जो पार्श्व वेंट्रिकल है. सीधे तीसरे निलय में इंजेक्शन वास्तव में गहरी diencephalic संरचनाओं को लक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह मानक, बंद-the-शेल्फ इलेक्ट्रोड के साथ E12.0 या E12.5 से हाइपोथेलेमस transfect करने के लिए संभव है. हम विशेष रूप से इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त नेपा जीन (चिबा, जापान) द्वारा निर्मित इलेक्ट्रोड के कुछ मिल गया है.

हमारी प्रक्रिया के साथ हम पूरी हाइपोथैलेमस neuroepithelium या इलेक्ट्रोड अभिविन्यास के आधार पर आंशिक, क्षेत्रीय अभिकर्मक के अभिकर्मक प्राप्त करते हैं. यहाँ हम यकीनन, mammillary शरीर transfecting द्वारा तकनीक का प्रदर्शनगहरे और सभी हाइपोथैलेमस नाभिक की सबसे धंसे हुए. इसके अतिरिक्त, हम संकल्प के सेलुलर स्तर तक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की विस्तृत ऊतकीय विश्लेषण नीचे दिखा.

Utero में माउस विकासशील मस्तिष्क transfecting के लिए अन्य तरीकों के साथ utero electroporation में की तुलना से चर्चा अनुभाग में पाया जा सकता है.

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Protocol

1. इंजेक्शन के लिए डीएनए और ग्लास Micropipettes की तैयारी

  1. अच्छी गुणवत्ता कांच micropipettes एमनियोटिक द्रव की कमी के कारण प्रारंभिक उच्च गर्भपात की दर को कम करने के लिए आवश्यक हैं. कांच micropipettes खींचने के लिए प्रक्रिया अच्छी तरह से 13,18,25 प्रलेखित किया गया है. हीट = 300, 1.2 मिमी व्यास केशिकाओं का प्रयोग सेटिंग पी = 500 के साथ एक पारंपरिक सूटर में पी -97 डिवाइस खींचा = 40 खींचो, वेग = 50; समय = 50. 3 मिमी "गर्त" तंतु (Sutter साधन FT330B) के साथ खींचने फ़िट. 2 मिमी आकार तंतु हमें कम संतोषजनक परिणाम के लिए मिले हैं. दूसरी ओर, micropipette के सुझावों के beveling हमारे लिए परिणामों में सुधार करने के लिए प्रतीत नहीं होता.
  2. 1 से 2 ग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए ग्रीन फास्ट 0.1% युक्त पीबीएस में शुद्ध, endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनए (सेल संस्कृति ग्रेड) भंग. फास्ट ग्रीन भ्रूण मस्तिष्क निलय में दिखाई इंजेक्शन समाधान कर देगा.
  3. कांच micropipette में डीएनए समाधान के 10 μl लोड. इंजेक्शन प्रणाली (पिको पम्प) या मुंह विंदुक को कांच micropipette जुड़ें.

2. संज्ञाहरण

एक हीटिंग पैड और सर्जिकल उपकरणों के साथ शल्य तालिका तैयार. भ्रूण के दृश्य की सुविधा के लिए ठंड में प्रकाश स्रोतों पर मुड़ें. उदाहरण एक गिलास मनका अजीवाणु के लिए उपयोग कर सर्जिकल उपकरण कीटाणुरहित.

तीन अलग संज्ञाहरण प्रक्रियाओं (चर्चा देखने के लिए) इस प्रोटोकॉल के लिए संभव हो रहे हैं. यहाँ हम हम (प्रवाह दर 0.5 एल / मिनट) संज्ञाहरण शामिल होने के लिए isoflurane साँस लेना का उपयोग कर, सबसे अच्छा विचार के साथ ही रखरखाव (प्रवाह दर 1 एल / मिनट) का वर्णन करेंगे.

  1. टयूबिंग की एक छोटी लंबाई से Komesaroff मार्क 5 संवेदनाहारी डिवाइस से जुड़ा एक (ताकि माउस दृश्यमान रहता है) पारदर्शी छोटे कंटेनर में गर्भवती माउस का परिचय दें.
  2. Isoflurane के साथ vaporizer भरें, तो डिवाइस से जुड़ी ऑक्सीजन बोतल खुली. Isofl में से एक या दो दालों उड़ाurane / निद्रावहन अंदर स्थापित करने के लिए माउस और घड़ी पकड़े कंटेनर में ऑक्सीजन (0.5 एल / मिनट)
  3. उन्हें सुखाने से रोकने के लिए और तुरंत अपने सिर पर प्रवाह संज्ञाहरण मुखौटा फिट करने के लिए मरहम के साथ अपनी आंखों को कवर, माउस बाहर ले जाओ.

3. उदर - भित्ति का कर्तन

  1. हीटिंग पैड (अन्यथा अपने शरीर का तापमान वसूली की संभावना कम है, बहुत तेजी से नीचे जाएगा) पर पेट माउस रखें और टेप के साथ पक्षों के लिए अपने चार पैर फिक्सिंग से जगह में अपने शरीर को सुरक्षित. पलटा उत्तेजना (फर्म दबाव के साथ जैसे पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी) के जवाब के नुकसान के लिए जाँच करके संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें.
  2. पेट की सतह दाढ़ी और iodophorpovidone आयोडीन (Braunoderm) के साथ कीटाणुरहित.
  3. पेट की त्वचा पर एक अनुदैर्ध्य चीरा (1 से 1.5 सेमी लंबे) बनाओ. फिर पेरिटोनियम में कटौती. चीरा के आसपास कपास धुंध रखें. एक गर्भाशय सींग दिखाई बनाओ और पीबीएस rinsed gauz पर कुंद संदंश के साथ सावधानी से इसे बाहर खींचई. बहुत बार यह हमेशा (आंकड़े 2A और 2 बी) सिक्त रखने के लिए पीबीएस के साथ गर्भाशय कुल्ला. पूरी प्रक्रिया के दौरान गर्भाशय के अंदर उच्च दबाव गर्भपात में जिसके परिणामस्वरूप इंजेक्शन पर तरल पदार्थ के नुकसान की संभावना बढ़ रही भ्रूण को प्रसारित होगा, क्योंकि तंग mesometrium या गर्भाशय खींच से बचने.

4. मस्तिष्क वेंट्रिकल में डीएनए इंजेक्शन

  1. मस्तिष्क निलय कल्पना की जा सकती है कि इस तरह से गर्भाशय पकड़ो. बड़े पैमाने पर एक प्रतिकूल स्थिति में है कि एक भ्रूण का स्थान बदलने नहीं है - यह केवल गर्भपात की संभावना बढ़ जाती है.
  2. ऊपर से भ्रूण के सिर को देखते हुए, बाएँ और दाएँ कॉर्टिकल गोलार्द्धों के बीच नेत्रहीन खाई या विदर स्थानीय बनाना. गोलार्द्धों भेद करने के लिए आसान कर रहे हैं और उन्हें अंदर पार्श्व निलय (लक्षित होने की नहीं) आम तौर पर कुछ गहरे रंग की आकृतियों के रूप में माना जा सकता है. एक भ्रूण (Figur डीएनए इंजेक्शन के लिए पूरी तरह से उन्मुख होना पाया जाता हैतों -2 सी और 2 डी), यह पियर्स गर्भाशय की दीवार संभव है और एक बार में तीसरे वेंट्रिकल दर्ज करें. के बारे में 1 मिमी के लिए मर्मज्ञ, गर्भाशय की दीवार और cortical गोलार्द्धों के बीच के अंतर की विजय - स्तम्भ अंत में पंचर यह करने के लिए 45 डिग्री पर कांच micropipette पकड़ो. इस तरह गिलास micropipette की नोक मस्तिष्क (नहीं पार्श्व वेंट्रिकल) (आंकड़े -2 सी और 2 डी) के तीसरे वेंट्रिकल में प्रवेश करेंगे. यह भ्रूण सिर के आसपास के क्षेत्र में पहले पियर्स गर्भाशय की दीवार (हमेशा 45 डिग्री से कम) के लिए उपयोगी है कम कृपापूर्वक उन्मुख भ्रूण में, कॉर्टिकल गोलार्द्धों के बीच सही स्थिति में micropipette टिप जगह है और उसके बाद ही मस्तिष्क छेदना. तीसरे वेंट्रिकल (एक अच्छा इंजेक्शन हरे तरल पदार्थ के साथ निलय भर जाता है) में डीएनए समाधान के 1 μl के बारे में इंजेक्षन. एक गर्भाशय सींग के सभी भ्रूण के साथ एक ही प्रक्रिया दोहराएँ. यह डीएनए समाधान के लिए कुछ समय निलय तरल पदार्थ के साथ समान रूप से मिश्रण और entir तक पहुँचने के लिए अनुमति देता हैई neuroepithelium.

5. Electroporation के लिए Hypothalamus लक्ष्य निर्धारण

  1. पर electroporator स्विच और भ्रूण उम्र (E12.5 के लिए हम 5 वर्ग तरंग दालों का उपयोग, 50 वी, 50 मिसे ON/950 मिसे रवाना) के अनुसार सेटिंग्स समायोजित. सकारात्मक पोल स्टेनलेस स्टील सुई इलेक्ट्रोड (CUY550-10) के रूप में और नकारात्मक पोल एक दौर फ्लैट इलेक्ट्रोड (CUY700P4L) के रूप में प्रयोग करें. (यह अन्यथा वर्तमान बस नहीं बल्कि इसके माध्यम से भ्रूण के चारों ओर बहती के बाद इलेक्ट्रोड, भ्रूण की तुलना में छोटे होते हैं कि महत्वपूर्ण है.)
  2. Electroporation के लिए जिसका पृष्ठीय पक्ष (यानी प्रयोगकर्ता की ओर मुड़े) ऊपर है (हैं उनमें से ज्यादातर के रूप में) उन भ्रूण का चयन करें, और जिसका अभिविन्यास अनुकूल नहीं है उन त्यागें. यह इथेनॉल कीटाणुरहित उंगलियों के साथ या दस्ताने के साथ गर्भाशय को छूने के लिए अब सुरक्षित है. संदंश के साथ गर्भाशय होल्डिंग, तथापि, electroporation के दौरान वर्तमान के प्रवाह के साथ हस्तक्षेप करेगा.
  3. पियर्स AMN के बीच भ्रूण के सिर से गर्भाशय की दीवारसुई इलेक्ट्रोड की नोक के साथ के माध्यम से यह नीचे की ओर thrusting द्वारा iotic थैली और अपरा. जोर ब्लॉक के रूप में दूसरे हाथ की तर्जनी का प्रयोग करें. इलेक्ट्रोड टिप के बारे में 5 मिमी मध्यमस्तिष्क (आंकड़े 2 ई और 2 एफ) के बारे में स्तर पर, एमनियोटिक थैली और गर्भाशय की दीवार के बीच अब होना चाहिए. इस "को लक्ष्य इलेक्ट्रोड" है, तो अपनी स्थिति हाइपोथैलेमस neuroepithelium का हिस्सा ट्रांसफ़ेक्ट करने के लिए सबसे अधिक संभावना है जो कि निर्धारित करेगा कि याद रखें. भ्रूण बहुत धीरे इलेक्ट्रोड के बीच "निचोड़ा हुआ" हो गया है.
  4. दूसरी ओर, स्थिति के साथ भ्रूण के सिर (आंकड़े 2 ई और 2 जी) की विपरीत दिशा में गर्भाशय की दीवार के बाहर दौर फ्लैट इलेक्ट्रोड.
  5. (950 मिसे रवाना, 5 वर्ग तरंग दालों पर 50 वी, 50 मिसे) वोल्टेज लागू करने के लिए पेडल स्विच का उपयोग करें.
  6. दूसरे हाथ की तर्जनी के साथ गर्भाशय वापस धारण करते हुए धीरे धीरे गर्भाशय की सुई इलेक्ट्रोड बाहर खींच - अगर amnioटिक तरल हवा निकाल दीवार के माध्यम से खो दिया है, आम तौर पर भ्रूण गर्भपात से गुजरना होगा. सभी भ्रूण के साथ प्रक्रिया दोहराएँ.
  7. पेट में गर्भाशय सींग लौटें और शेष सींग में इंजेक्शन और electroporation दोहराएँ.

6. सर्जरी फिनिशिंग

  1. सभी भ्रूण के इंजेक्शन और electroporation के बाद, वे इसे बंद करने से पहले नमक के साथ peritoneal गुहा पहले और नम थे बिल्कुल के रूप में तैनात है, बहुत ध्यान से पेट में वापस गर्भाशय जगह है.
  2. शल्य तार (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914) के साथ पेरिटोनियम सीवन. त्वचा के उपयोग को बंद करने के लिए methodwith एक अधिक प्रतिरोधी सिवनी (Supramid नायलॉन, 6-0, Serag Wiessner 07171L के लिए) "सिलाई बाधित".
  3. Povidone आयोडीन (Braunoderm) के साथ पेट की सतह कीटाणुरहित और एक गैर स्टेरॉयड subcutaneously विरोधी भड़काऊ (जैसे 0.9% NaCl में Rimadyl की एक 1:10 समाधान के 100 μl) या, और भी बेहतर, बू की तरह एक opioid इंजेक्षनprenorphine (Temgesic, 0.9% NaCl में 0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) दर्द को दूर करने के लिए.
  4. संवेदनाहारी मशीन से मां निकालें और एक हीटिंग पैड से गरम किया जाता है जो एक पिंजरे में डाल दिया है. यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है जब तक लगातार माउस मॉनिटर. बाद में, वे संक्रमण या दर्द का कोई संकेत के बिना प्रक्रिया से उबर रहे हैं बीमा करने के लिए दैनिक जानवरों की जाँच करें.

7. परिणाम का विश्लेषण

  1. विश्लेषण के वांछित दिन के अनुसार भ्रूण (या postnatals) हार्वेस्ट. प्रसव के बाद चूहों (1 से 2 दिन पुराना) कत्ल के द्वारा मारे गए हैं.
  2. पिछले electroporation के एनोटेशन के अनुसार हर भ्रूण अलग करें. एक stereomicroscope के तहत मस्तिष्क काटना और उपयुक्त क्षेत्र में हरे रंग का फ्लोरोसेंट संकेत (GFP रिपोर्टर से) के लिए खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें.
  3. चयनित मस्तिष्क "ताजा" विश्लेषण किया जा सकता है: 4% paraformaldehyde में थोड़े समय के लिए ऊतकों को ठीक और agarose 4% में या जिलेटिन एक में एम्बेडlbumin, तो एक vibratome प्रकार के उपकरण पर धारा (3 चित्र). अधिक विस्तृत immunohistochemical विश्लेषण के लिए (चित्रा 4), अक्टूबर बढ़ते मध्यम (ऊतक टेक) में एम्बेड 30% शर्करा समाधान, में मस्तिष्क क्रायो रक्षा तो एक cryostat में 20 माइक्रोन वर्गों में कटौती.

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Representative Results

हाल हाइपोथेलेमस न्यूरॉन्स कुछ कम माउस विकास 27,28 में अनुवाद चूहे 26 में जन्म डेटिंग विश्लेषण के अनुसार, E11.5 बीच E15.2 करने के लिए पैदा कर रहे हैं. हाइपोथैलेमस neurogenesis के शिखर E12.5 29-31 पर पहुंच गया है. तदनुसार, वर्तमान अध्ययन (E12.5) के लिए चुना अभिकर्मक उम्र में, hypothalamic न्यूरॉन्स का एक बड़ा हिस्सा किसी भी rostro-दुम स्तर पर लेबल किया जा सकता.

मोटी vibratome प्रकार वर्गों पर E18.5 पर विश्लेषण (आंकड़े 3 ए और 3 बी) हाइपोथैलेमस neuroepithelium की पूरी rostro-दुम का विस्तार इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 3) के लिए सुलभ है कि पता चलता है. किसी भी उम्र में, न्यूरॉन्स वंश पढ़ाई 32 के साथ समझौते में, सभी Medio पार्श्व स्तर (3B चित्रा) में लेबल किया जा सकता. mammillary शरीर (MBO) सबसे ventra में एक अवकाश अस्तर neuroepithelium से विकासशील एक neuronal नाभिक हैएल और अग्रमस्तिष्क की दुम का भाग. इस लक्ष्य को सिद्धांत रूप में MBO बहुत कठिन बना देता है. कार्यात्मक, MBO के अग्रगामी भूलने की बीमारी 33 में स्मृति समेकन और उसके रोग अध: पतन के परिणाम के लिए एक महत्वपूर्ण संरचना है. हम इस नाभिक (आंकड़े -3 सी और 3 डी) में बहुत विशेष संवाददाता प्लास्मिड transfect करने में सक्षम है. MBO के न्यूरॉन्स भी अभिकर्मक (चित्रा -3 सी में तीर) के बाद चिह्नित कर रहे हैं जो दो बहुत विशेषता और कार्यात्मक महत्वपूर्ण इलाकों बनाने एक्सोन हूं. ट्रांसवर्स वर्गों (चित्रा 3 डी) (अभिकर्मक प्रयोग जगह ले ली से पहले यानी) E12.5 (अभिकर्मक की उम्र) में जन्म न्यूरॉन्स पहले उत्पन्न न्यूरॉन्स की एक गैर लेबल मास के चारों ओर एक घुमावदार "परत" के रूप में दिखाते हैं.

फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन, परिणाम के लिए करीब एक विश्लेषण की मदद से मोटी वर्गों पर परीक्षा से पता चला सामान्य प्रवास पैटर्न परे poss हैible cryostat वर्गों पर विशेष एंटीबॉडी का उपयोग कर (चित्रा 4). यहाँ चुना उदाहरण का विश्लेषण करने के लिए, MBO, हम mammillary अवकाश (चित्रा -4 ए) से निकलती रेडियल glial प्रक्रियाओं के विमान के समानांतर क्षैतिज वर्गों तैयार. हम तो GFP (चित्रा 4 बी) के खिलाफ एंटीबॉडी के माध्यम से E12.5 पर लेबल neuroepithelium से पैदा MBO के न्यूरॉन्स की पहचान की. जैसी कि उम्मीद थी, एंटीबॉडी MBO कोशिकाओं का एक प्रतिबंधित समूह (आंकड़े 4B, 4C, और 4D में नोक) लेबल. दो से पहले (पार्श्व) और (औसत दर्जे का) E12.5 के बाद पैदा हुए MBO के न्यूरॉन्स के लिए क्रमशः इसी पार्श्व और औसत दर्जे MBO के क्षेत्रों unlabeled के बीच इस समूह में स्थित था. एक उदाहरण के रूप में, यहाँ हम neuroepithelium के रेडियल glial प्रक्रियाओं पर अलग - अलग लेबल न्यूरॉन्स के प्रवास मोड में दिखाने के लिए nestin (आंकड़े 4C और 4D में लाल) के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ सह दाग.


चित्रा 1. Midgestation पर Hypothalamus और प्रांतस्था के सापेक्ष पदों. बाण के समान (ए) और अनुप्रस्थ (बी) सबसे पृष्ठीय और सबसे सतही अग्रमस्तिष्क संरचना, प्रांतस्था (CTX, नीला) के रूप में अच्छी तरह से सबसे अधिक गहराई के रूप में दिखा एक midgestation माउस भ्रूण के मस्तिष्क के चित्र रखा अग्रमस्तिष्क संरचना, हाइपोथैलेमस (हरियाणा, लाल).

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रक्रिया का आरेख. (ए) गर्भवती बांध anesthetized है और गर्भाशय अवगत कराया. (ख) प्रत्येक गर्भाशय सूजन में, अपरा प्रविष्टि (काला नोक) की पहचाननाल (पीएल) और भ्रूण. एमई, mesometrium. (सी) को छोड़ दिया और सही कॉर्टिकल गोलार्द्धों (लाल एक्स) के बीच में इंजेक्शन बिंदु को पहचानें. (डी) तीसरे वेंट्रिकल में डीएनए समाधान इंजेक्षन. (ई) सुई इलेक्ट्रोड (सकारात्मक) गर्भाशय की दीवार में छेद भ्रूण और अपरा प्रविष्टि के बीच. फ्लैट इलेक्ट्रोड (नकारात्मक) गर्भाशय से मुक्त पक्ष पर टिकी हुई है. हाइपोथेलेमस साथ सकारात्मक इलेक्ट्रोड की स्थिति दिखा अपरा ओर से (एफ) काल्पनिक दृश्य. (जी) की स्थिति दिखाने के गर्भाशय से मुक्त तरफ से देखें नकारात्मक इलेक्ट्रोड.

चित्रा 3
चित्रा 3. पूरे हाइपोथेलेमस या इसे का हिस्सा transfecting. चार अलग से मोटी हिल-सूक्ष्म वर्गोंE12.5 पर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन GFP (ए, सी) या CFP (बी, डी) ले जाने प्लाज्मिड डीएनए के गर्भ अभिकर्मक में बाद हाइपोथेलेमस दिखा जंगली प्रकार E18.5 माउस दिमाग. (ए) के बाण के समान अनुभाग (बाईं ओर विजय - स्तम्भ) विजय - स्तम्भ से दुम को ट्रांसफ़ेक्ट एक हाइपोथेलेमस दिखा. स्केल बार 500 माइक्रोन. (बी) अनुप्रस्थ अनुभाग. ट्रांसफ़ेक्ट तरफ, लेबल कोशिकाओं सभी Medio पार्श्व स्तरों पर पाया जा सकता है. (सी) बाण के समान अनुभाग एक विशेष रूप से ट्रांसफ़ेक्ट mammillary शरीर (धराशायी लाइन, तारांकन) दिखा रहा है और इसकी विशेषता axonal पेड़ (तीर) की लेबलिंग. (डी) अनुप्रस्थ अनुभाग mammillary शरीर के माध्यम से (धराशायी लाइन). पर electroporated के पक्ष (तारांकन), E12.5 पर जन्म न्यूरॉन्स को इसी लेबल बैंड देखा जा सकता है. लुका, हाइपोथैलेमस, गु, चेतक

चित्रा 4 4 चित्रा. हाइपोथैलेमस विकास में विशेष कदम का विश्लेषण. Mammillary शरीर (लाल) दिखा विकासशील मस्तिष्क के माध्यम से एक क्षैतिज खंड (ए) आरेख. क्षेत्र में दर्शाया (बी) और (सी) फंसाया है. E12 पर GFP अभिकर्मक के बाद E18.5 mammillary शरीर के माध्यम से एक क्षैतिज खंड पर GFP के (बी) एंटीबॉडी लेबलिंग. E12.5 में पैदा कोशिकाओं नाभिक में एक अलग बैंड (बी में नोक, सी और डी) के रूप में. स्केल बार 100 माइक्रोन. खंड पर neuroepithelial मार्कर nestin (लाल) (सी) एंटीबॉडी लेबलिंग (बी) में दिखाया गया है. स्केल बार 100 माइक्रोन. (डी) व्यक्तिगत कोशिकाओं को उच्च वृद्धि के तहत mammillary शरीर में विशिष्ट E12.5 बैंड में पहचाना जा सकता है. 20 माइक्रोन स्केल बार.

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Discussion

संज्ञाहरण के बारे में: हाइपोथेलेमस में utero electroporation में तकनीकी रूप से कठिन हो सकता है और लंबे समय तक निद्रावहन समय की आवश्यकता होती है सकते हैं, हम ऑक्सीजन और isoflurane के एक मिश्रण के प्रशासन के माध्यम से संज्ञाहरण प्रेरित करने और बनाए रखने के लिए पसंद करते हैं. हमारे अनुभव में, जानवरों कम से कम, माँ की वसूली बहुत तेजी से है, और भ्रूण के अस्तित्व में सुधार एक घंटा तक की अवधि के लिए इस तरह से उपयुक्त रूप anaesthetized रह सकते हैं. संज्ञाहरण के लिए अन्य तरीकों में भी उपलब्ध हैं. सबसे सरल प्रक्रिया की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा निद्रावहन उत्प्रेरण और बनाए रखने के होते 2.5 0.9 में मिलीग्राम / Ketamine (25 मिग्रा / मिली), Xylazin (1.2 मिलीग्राम / एमएल) और Acepromazin (0.35 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण के शरीर के वजन के प्रति किलो % बाँझ NaCl ("ट्रिपल कॉम्बो"). अकेले इस मिश्रण के साथ, यहाँ की सिफारिश की खुराक पर, के बारे में 30 मिनट (कुछ मामलों में करने के लिए 45 मिनट) के एक निद्रावहन प्रेरित है. यह आमतौर पर पर्याप्त E12.5 पर प्रांतस्था में utero electroporation में के लिए (inj के माध्यम से होता हैपार्श्व वेंट्रिकल में ection). इस विधि का लाभ यह है कि यह पूरी तरह से एक निद्रावहन डिवाइस और अन्य उपकरणों की जरूरत से बचा जाता है. सर्जरी की लंबी समय जरूरी हैं हालांकि, अगर intraperitoneal संज्ञाहरण के इस प्रकार से anesthetized जानवर में आगे इंजेक्शन संज्ञाहरण अवधि को लम्बा खींच करने के क्रम में अक्सर मौत के बाद कर रहे हैं, के बाद से सिफारिश नहीं है. यह पहली बार निद्रावहन प्रेरित करने के लिए 'ट्रिपल कॉम्बो "(ऊपर) के लिए इंजेक्शन का उपयोग करके intraperitoneal और साँस लेना संज्ञाहरण गठबंधन करने के लिए भी संभव है, तो isoflurane / ऑक्सीजन की साँस लेना द्वारा इसे बनाए. यह आवश्यक है के रूप में इस विशेष विधि के साथ निद्रावहन रूप में लंबे समय के लिए बनाए रखा जा सकता है, आपरेशन के बाद गर्भवती माउस की वसूली अकेले साँस लेना के रूप में अच्छा नहीं है. इसके अलावा, हम "ट्रिपल कॉम्बो" intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग करें, जब भी भ्रूण अस्तित्व कम हो जाती है.

भ्रूण के सिर पर इलेक्ट्रोड की स्थिति के रूप में दर्शाया

laparotomy के काफी सरल है. हालांकि, प्रयोगकर्ता के एक फ्लैट से सीखने की अवस्था के बाद भ्रूण की उच्च अस्तित्व अनुपात (बिजली दालों के प्रशासन द्वारा पीछा intraventricular इंजेक्शन के बाद) के लिए अनुमति देता है कि कौशल के स्तर तक पहुँचता है. व्यक्तिगत कौशल सामान्य और विशेष रूप से हाइपोथैलेमस के लिए अपने आवेदन में utero electroporation में कुछ छात्रों के लिए पूरी तरह से व्यावहारिक नहीं साबित कर सकते हैं कि एक महत्वपूर्ण कारक है . सीखने की अवधि को छोटा करने के साथ ही हम यह उपयोगी के लिए भ्रूण की संख्या और स्थिति के बारे में जानकारी सहित एक विस्तृत प्रोटोकॉल, और उपस्थिति, इंजेक्शन की गुणवत्ता और इलेक्ट्रोड की अनुमानित स्थान को भरने के लिए मिल गया है reproducibility और सांख्यिकीय विश्लेषण को बढ़ाने के लिए व्यक्तिगत भ्रूण. एक भ्रूण के द्वारा भ्रूण आधार पर, अंतिम परिणाम के साथ प्रयोग के बारे में इन आंकड़ों की तुलना समझते हैं और प्रक्रिया में सुधार के लिए उपयोगी साबित हो गया है.

अन्य रिपोर्टों 20,21 Nepagene चिमटी से नोचना प्रकार इलेक्ट्रोड के साथ हाइपोथेलेमस को लक्षित किया है. हम लगातार एक सुई इलेक्ट्रोड के आवेदन और एक ही निर्माता से एक फ्लैट कवर इलेक्ट्रोड के साथ बेहतर परिणाम प्राप्त करते हैं. हमारे अनुभव में, इस विधि का उपयोग आसान लक्षित कर rostro-दुम बनाता है. चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड उपयोगी परिणाम के क्रम में या तो अधिक अनुभव / कौशल या प्रयोगों की एक बहुत बड़ी संख्या की आवश्यकता है लगता है.

jove_content "> विकासशील माउस हाइपोथेलेमस में डीएनए निर्माणों transfect करने के लिए कम से कम दो अन्य तरीकों utero electroporation में की तुलना में किया जा सकता है. पहले एक भी भ्रूण मस्तिष्क निलय, ब्याज की डीएनए जा रहा है कि अंतर में laparotomy और इंजेक्शन पर आधारित है एक वायरल कण द्वारा किए वायरस neuroepithelial कोशिकाओं को संक्रमित करता है और इस तरह से हमारे प्रयोगात्मक निर्माण transfects - कोई इलेक्ट्रोपोरेशन जरूरत है लाभ:.. प्रक्रिया electroporation के लिए आवश्यक बिजली दालों से बचा जाता है, इसलिए भ्रूण अस्तित्व शायद बेहतर बनाता है इस पद्धति का मुख्य नुकसान. हैं: 1) वायरस के साथ काम विशेष सावधानियों और S2 सुविधाओं की आवश्यकता है, वायरल कणों (बेशक अभिकर्मक के कुछ डिग्री के किसी भी neuroepithelial क्षेत्र transfect करने के लिए समान रूप से होने की संभावना सिद्धांत रूप में इसे बनाने के पूरे निलय में फैला होगा, लक्ष्यीकरण सवाल से बाहर है 2) में रुचि का क्षेत्र) होने की संभावना है. बेशक, utero में utero electroporation में के रूप में, प्रयोगकर्ता की व्यक्तिगत कौशल पर दृढ़ता से निर्भर करता है एक लंबे समय सीखने की अवस्था के साथ, अपेक्षाकृत कठिन सर्जरी प्रक्रिया यानी अनिवार्य रूप से एक ही समस्या बन गया है.

यह गर्भवती माउस के रक्त प्रवाह में transfect करने निर्माणों के इंजेक्शन पर आधारित है दृष्टिकोण के अन्य समूह है, पूरी तरह से सर्जरी से बचा जाता है. क्षेत्र विशेष लक्ष्यीकरण इस विधि के साथ संभव नहीं है हालांकि shRNA 34,35 या प्लास्मिड 36 की पूंछ नस (दुम नस) इंजेक्शन, आनुवंशिक रूप से बहुत जल्दी भ्रूण में हेरफेर करने की क्षमता है. यह आशाजनक दृष्टिकोण अभी तक सामान्य आवेदन के लिए तैयार नहीं लगती. नवजात चूहों (नहीं बल्कि बड़े चूहों) के चेहरे की नस में इंजेक्शन वायरल कणों (एडिनो से जुड़े वायरस) मस्तिष्क न्यूरॉन्स 37 transfect करने में सक्षम है. अंत में, अंत में डीएनए वाहक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जो नैनोकणों, पूंछ वी के बाद मस्तिष्क तक पहुँच सकते हैंवयस्क चूहों 38 में ईआईऍन इंजेक्शन. बहुत जल्दी भ्रूण transfecting की संभावना खुला, जो इन दो तरीकों,, अभी तक गर्भवती चूहों पर इस्तेमाल नहीं किया गया हमारे ज्ञान करने के लिए है.

अभिकर्मक और संग्रह की उम्र: प्रक्रिया सीखने के लिए, यह E14.5 भ्रूण transfect करने का प्रयास करें, और तब पहले, अधिक मुश्किल भ्रूण उम्र पर आगे बढ़ने की शायद सबसे अच्छा है. हमारे अनुभव में, GFP अभिव्यक्ति अभिकर्मक के बाद पहले से ही पराबैंगनी प्रकाश के तहत 24 घंटा दिख रहा है. E12.5 अभिकर्मक के बाद, E18.5 पर GFP अभिव्यक्ति बहुत मजबूत है. हम E12.5, E13.5, E14.5, और E15.5 में electroporated और E17.5, E18.5, P0 और सभी मामलों में मजबूत संवाददाता अभिव्यक्ति मिल पा रहा P1 पर विश्लेषण किया है. जिसका दिमाग utero में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है भ्रूण (प्रसव के बाद डेटा संग्रह के लिए) अवधि तक पहुँचने के लिए अनुमति दी जाती है, कभी कभी वे चुनिंदा मां द्वारा खाया जाता है. यह मस्तिष्क में गड़बड़ी से प्रेरित पिल्ला उपस्थिति या व्यवहार में सूक्ष्म परिवर्तन (उनके तापमान का पता चलता हैऊपरी कम हो सकता है, या शायद वे) सही ध्वनि फेंकना संकेत नहीं है. मातृ मुर्गियों को मारने के जीवित रहने उन है कि प्रसव के बाद पशुओं में, हम कम से कम पी 1 जब तक संवाददाता अभिव्यक्ति ऊपर रखा है. यहां तक कि चार महीने के जन्म के बाद 10 ट्रांसफ़ेक्ट निर्माणों के साहित्य शो अभिव्यक्ति में रिपोर्ट.

Electroporation के लिए वैक्टर: हम उदाहरण के लिए, एक फ्लोरोसेंट संवाददाता के सीडीएनए से, एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (IRES) 40 के द्वारा अलग, ब्याज की जीन की सीडीएनए द्वारा पीछा सीएजी प्रमोटर 39, के द्वारा संचालित bicistronic संवाददाता प्लास्मिड उपयोग बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 41. सीएजी प्रमोटर यह उन्हें हत्या, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए भी उच्च डीएनए के स्तर का उत्पादन कर सकते हैं कि न्यूरॉन्स में इतना मजबूत है. हम अभिकर्मक, एक संभव समाधान के बाद बड़े पैमाने पर apoptosis को कभी नहीं देखा है, समस्या प्रकट करना चाहिए, EF1 अल्फा 42 की तरह, एक कम कुशल प्रमोटर का उपयोग किया जाएगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम में जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (ड्यूश Forschungsgemeinschaft) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  REAGENTS
Acepromazine Sanofi GmbH anesthetic
Isoflurane Baxter HDG9623 anesthetic
Ketamin Pharma GmbH anesthetic
Fast Green Fluka 44715  
Rimadyl Pfizer non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm Braun 3887138 povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS Gibco 14190  
Temgesic (buprenorphine) Essex Pharma opioid analgesic
Eye Ointment Pan-Ophtal 7136926  
Xylazine Bayer  
  EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 Medical Developments Australia ACN 004 903 682  
Capillary puller P-97 Sutter Instrument Co. P-97  
Compresstome Precisionary Instr. VF-300 Vibratome-type device
Confocal Microscope Zeiss LSM700  
Cryostat Leica CM3050S  
Electroporator Nepa Gene Co. Ltd. CUY21EDIT  
Electrode 1 Nepa Gene Co. Ltd. CUY550-10 Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2 Nepa Gene Co. Ltd. CUY700P4L Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source Leica KL2500 LCD  
Glass capillaries Harvard Apparatus GC120T-15 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer Fine Science Tools FST250  
Heating pad Harvard Apparatus py872-5272  
Injection device World Precision Instruments Pneumatic Pico Pump PV820  
Suture Thread Coated Vicryl Ethicon V4914 Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid Serag Wiessner TO07171L Skin Suture

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References

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