लार्वा zebrafish में प्रमस्तिष्कवाहिकीय विकास की इमेजिंग वर्णित है. 3 डी इमेजिंग की सुविधा और रासायनिक उपचार का उपयोग प्रमस्तिष्कवाहिकीय विकास को संशोधित करने के लिए तकनीक भी उपलब्ध कराए गए हैं.
Zebrafish विवो में विकासात्मक जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. छोटे आकार और zebrafish भ्रूण के रिश्तेदार पारदर्शिता जैसे हृदय और संवहनी विकास के रूप में प्रक्रियाओं के दृश्य परीक्षा के लिए उन्हें विशेष रूप से उपयोगी है. कई हाल ही के अध्ययन में संवहनी endothelial कोशिकाओं में EGFP व्यक्त कि ट्रांसजेनिक zebrafish छवि का इस्तेमाल किया गया और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, मस्तिष्क और रेटिना में जटिल संवहनी नेटवर्क का विश्लेषण. वर्णन, तैयार इलाज के लिए और छवि बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) व्यक्त कि zebrafish भ्रूण, और फिर प्रमस्तिष्कवाहिकीय प्रणाली की व्यापक 3 डी renderings उत्पन्न करने के लिए प्रदान की जाती हैं. प्रोटोकॉल भ्रूण के उपचार, confocal इमेजिंग, और EGFP प्रतिदीप्ति संरक्षित है कि निर्धारण प्रोटोकॉल में शामिल हैं. इसके अलावा, इस तरह के हानिकारक पास तंत्रिका ऊतक के बिना हटाने आंख के रूप में प्रमस्तिष्कवाहिकीय संरचनाओं के उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने पर उपयोगी सुझाव प्रदान की जाती हैं. संभावित नुकसानconfocal इमेजिंग के साथ स्वतंत्र रूप से उपलब्ध खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर confocal छवि के ढेर से 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम के साथ साथ चर्चा कर रहे हैं.
Zebrafish विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करते हैं, और उनके भ्रूण के रिश्तेदार पारदर्शिता इमेजिंग आधारित अध्ययन 1 के लिए उत्तरदायी है. zebrafish अब दशकों के लिए हड्डीवाला विकास के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है. Zebrafish सहित teleosts, अकशेरूकीय में कोई उचित Homolog है कि एक सरलीकृत हड्डीवाला नाड़ी तंत्र है. खून oxygenated है जहां गहरे नाले के माध्यम से एक दो संभाग दिल की पूर्वकाल कक्ष से पंप है. गहरे नाले से रक्त पृष्ठीय महाधमनी पर converges और कहा कि छोटे और छोटे जहाजों में शाखा धमनियों, अंग के ऊतकों में अंततः तक पहुँचने केशिकाओं से होकर गुजरता है. केशिकाओं ऑक्सीजन के भीतर जारी है और कार्बन डाइऑक्साइड अवशोषित कर लेता है. केशिकाओं की शिरापरक तरफ खून बड़ा और बड़ा रगों में बहती है और अंत में चक्र को दोहराता है, जहां दिल के पीछे कक्ष में तैयार की है.
एक वयस्क zebrafish एक समय में 200 या उससे अधिक अंडे देना, और ONC कर सकते हैंई निषेचित, वे जल्दी से 2 का विकास. एक दिन के भीतर शरीर अक्ष में अच्छी तरह से कोरियोनिक झिल्ली के अंदर चारों ओर भ्रूण कदम है कि अनुबंध और मांसपेशियों सहित विकसित कर रहा है. 2-7 दिनों से पोस्ट निषेचन (DPF) सबसे शरीर प्रणालियों आँखें और भोजन की ओर या दूर चमकदार रोशनी से तैराकी समन्वय कर सकते हैं कि एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सहित, विकास. ऊपर से 7 DPF भ्रूण माइक्रोस्कोपी के साथ दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए काफी छोटे हैं. फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि ट्रांसजेनिक लाइनों confocal या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ imaged किया जा सकता है. Confocal इमेजिंग संवहनी विकास का एक सिस्टम जीवविज्ञान दृष्टिकोण प्रदान करते हैं कि zebrafish भ्रूण में पूरा संवहनी संरचनाओं के 3 डी renderings बनाने के लिए खुला स्रोत सॉफ्टवेयर 3 के साथ जोड़ा जा सकता है. यह संवहनी नेटवर्क 4,5 के एक सिस्टम स्तर के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है के रूप में संवहनी और cerebrovascular जटिलता में परिवर्तन के साथ संबंध अध्ययन इस प्रोटोकॉल से लाभ होगा. तरीकों और संसाधनों का एक संकलन प्रदान कर रहे हैंभ्रूण zebrafish में संवहनी संरचनाओं के इमेजिंग की आवश्यकता है कि अध्ययन के लिए आसान गोद लेने के लिए और इन तकनीकों की अनुमति देने के लिए डी. एक पशु मॉडल के रूप में zebrafish की लागत दक्षता हड्डीवाला विकास और homeostasis में आणविक मार्ग की वाहिकाजनक प्रभाव का आकलन करने के साथ जो नए प्लेटफार्म प्रदान करने के लिए उभरती प्रौद्योगिकियों इमेजिंग के साथ संयोजन है.
यहाँ वर्णित विधि zebrafish विकसित करने में नाड़ी तंत्र के दृश्य के अध्ययन के लिए एक आधार प्रदान करते हैं. तय नमूने उच्च संकल्प confocal इमेजिंग. ड्रोसोफिला और सी. के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि लाइव नमूनों, इस तरह के हृदय की दर और दिल स्ट्रोक मात्रा के रूप में शारीरिक मापदंड, का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एलिगेंस पूरे शरीर इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन zebrafish रीढ़ हैं और एक endothelial सेल लाइन नाड़ी तंत्र सहित हड्डीवाला ऊतकों के लिए एक उपयोगी मॉडल, प्रदान करते हैं. इन अध्ययनों zebrafish अनुसंधान समुदाय से महत्वपूर्ण ट्रांसजेनिक लाइनों और जीनोमिक संसाधनों को शामिल कर सकते हैं. 3D पुनर्निर्माण और भ्रूण zebrafish से confocal छवियों का प्रतिपादन, यहाँ वर्णित है, संवहनी शाखाओं में बंटी और इस तरह के चूहों और चूहों के रूप में बड़ा पशु मॉडलों के साथ संभव नहीं है कि रक्त वाहिका घनत्व के लिए एक सिस्टम जीवविज्ञान दृष्टिकोण के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, zebrafish एक परिवर्तनीय पर्यावरण (E3 बफर) में विकसित अम्निओट जीवों के रूप में, जहां एक बड़ी आसानी से सी जोड़ सकते हैंसंवहनी विकास को प्रभावित करने वाले विशिष्ट एंजाइमों या अन्य प्रक्रियाओं को बाधित कि hemicals. रासायनिक वितरण की एकाग्रता और समय शोधकर्ता को ठीक धुन उपचार शर्तों को सक्षम करने, बदला जा सकता है.
1. संशोधन और निवारण
इस प्रणाली के लिए संशोधन ऊतक, अंग या क्षेत्र विशेष पैटर्न 10 की एक किस्म में EGFP या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि zebrafish के ट्रांसजेनिक लाइनों को शामिल कर सकते हैं. इसके अलावा, zebrafish रेटिना में neovascular परिवर्तन का विश्लेषण हाल ही में 5 प्रकाशित किया गया है. पुराने भ्रूण और वयस्क zebrafish में रंजकता के साथ कोई समस्या पैमाने पिगमेंट या रेटिना वर्णक उपज नहीं है कि ट्रांसजेनिक लाइनों के साथ पार करके मुआवजा दिया जा सकता है. कम प्रतिदीप्ति के साथ कोई समस्या आम तौर पर अनुचित निर्धारण की स्थिति से परिणाम. 1 दिन के लिए paraformaldehyde (4%) इष्टतम है, लेकिन इस तरह के glutaraldehyde, आज़मियम tetroxide या शराब के रूप में मजबूत fixatives मईEGFP प्रतिदीप्ति नष्ट. निर्धारण के बाद, भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रखा जाना चाहिए और हमेशा सीधे धूप से रक्षा की.
इस तकनीक के 2. सीमाएं
इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पादन 3 डी renderings की गुणवत्ता और संकल्प उत्पन्न छवियों की गुणवत्ता पर निर्भर करती है. इन भ्रूण के माध्यम से प्रकाश पैठ एक मानक confocal खुर्दबीन का उपयोग मध्य बाण के समान विमान तक सीमित है. इमेजिंग के इस पहलू पुराने भ्रूण और वयस्कों में इमेजिंग की गहराई सीमा है, लेकिन और अधिक उन्नत बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी प्रणाली अधिक से अधिक गहराई में इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं.
मौजूदा तरीकों के संबंध में 3. महत्व
इस प्रोटोकॉल एक संपूर्ण जानवर शामिल कर सकते हैं कि एक सिस्टम स्तर पर रक्त वाहिका नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है. इस तरह के डेटा की इससे पहले अभ्यावेदन अक्सर एक साथ बाहर रखी छवियों की श्रृंखला पर भरोसा किया, लेकिन 3 डी प्रतिपादन स्थानिक असली का बेहतर समाधान प्रदान करता हैशामिल tionships.
4. भविष्य अनुप्रयोगों
इमेजिंग और ऊतक प्रसंस्करण में नई घटनाओं पुराने भ्रूण या वयस्कों पारदर्शी 11-14 बनाने शामिल हो सकते हैं कि इन तरीकों के लिए कई नए अनुप्रयोगों प्रदान करेगा. बढ़ी पारदर्शिता बहुत confocal और बहु – फोटोन पराबैंगनीकिरण से ऊतक प्रवेश में वृद्धि होगी. इसके अलावा, कैमरों और photomultiplier ट्यूब की गति के रूप में यह जल्द ही विश्लेषण का एक 4 वें आयाम प्रदान करने, वास्तविक समय में मछली की 3 डी renderings का उत्पादन संभव हो सकता है वृद्धि हुई है.
5. महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम उचित निर्धारण भी शामिल है जो इमेजिंग, के लिए तैयारी है. इमेजिंग उपलब्ध सर्वश्रेष्ठ संख्यात्मक apertures है कि उच्च गुणवत्ता के उद्देश्यों के साथ निर्धारण के बाद जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए. रिजोल्यूशन इमेजिंग प्रणाली पर निर्भर करता है, ताकि उच्च गुणवत्ता प्रणाली आम तौर पर बेहतर कर रहे हैं. 3 डी renderings सृजन स्मृति गहन हैस्मृति और अच्छा ग्राफिक्स प्रोसेसर की एक बड़ी राशि के साथ तो नए, उच्च अंत कंप्यूटर के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
इन तरीकों न्यूरॉन्स, मांसपेशियों, ग्रंथियों या के किसी भी संख्या की आबादी में, GFP, या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि ट्रांसजेनिक भ्रूण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि यहां वर्णित दृश्य जीव विज्ञान प्रणाली, संवहनी endothelial कोशिकाओं में EGFP व्यक्त कि ट्रांसजेनिक zebrafish के लिए अनुकूलित किया गया है अन्य कोशिकाओं. इस प्रणाली के साथ काम करने में बड़ा लाभ यह निश्चित और / या जीवित पशुओं में, यह विकास की अवधि के दौरान किसी भी समय पूरे भ्रूण में क्या हो रहा है अध्ययन करने की क्षमता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों इन तकनीकों का विकास में मदद की जो हमारी प्रयोगशालाओं के अतीत और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद. आंशिक धन पुनर्योजी चिकित्सा / सीआईआरएम (RN1-00538) के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा डे के लिए प्रदान की है.
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |