הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.
דג הזברה הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה התפתחותית ופתולוגיה בגוף חי. הגודל הקטן ושקיפות היחסית של עוברי דג הזברה להפוך אותם שימושי במיוחד לבדיקה ויזואלית של תהליכים כגון לב והתפתחות כלי דם. בכמה מחקרים שנעשה לאחרונה דג הזברה מהונדס המבטא EGFP בתאי האנדותל של כלי דם שימשו לתמונה ולנתח את רשתות כלי דם מורכבות במוח וברשתית, באמצעות מיקרוסקופיה confocal. תיאורים מסופקים להכין, לטפל ותמונה עוברי דג הזברה שמבטאים את החלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), ולאחר מכן ליצור הדמיות 3D מקיפות של מערכת כלי הדם במוח. פרוטוקולים כוללים את הטיפול בעוברים, הדמיה confocal, ופרוטוקולי קיבעון שלשמר הקרינה EGFP. יתר על כן, עצות שימושיות על קבלת תמונות באיכות גבוהה של מבני כלי דם במוח, כגון הסרת עין ללא רקמה עצבית סמוכה מזיקה מסופקות. בעיות פוטנציאליותעם ההדמיה confocal הם דנו, יחד עם הצעדים הדרושים כדי ליצור 3D שחזורים מארובות תמונת confocal באמצעות תוכנת קוד פתוח זמינה באופן חופשי.
דג הזברה לספק מערכת רבת עוצמה כדי לחקור ביולוגיה התפתחותית, והשקיפות היחסית של העוברים שלהם ניתנת למחקרים מבוססי הדמיה 1. החברה דג הזברה שמשה כמודל לפיתוח חוליות במשך עשרות שנים. Teleosts, כוללים דג הזברה, יש מערכת כלי דם חוליות פשוטה שאין לו הומולוג סביר בחסרי חוליות. דם נשאב מהלשכה הקדמית של לב שני תאיים דרך זימים, שם הוא מחומצן. דם מהזימים מתכנס באב העורקים הגב ועובר דרך עורקי הסניף לתוך כלי קטן יותר ויותר, בסופו נימי לכת ברקמות איברים. בתוך חמצן נימים הוא שוחרר ופחמן דו חמצני נספג. בצד הוורידים של נימי דם זורם לורידים גדולים יותר ויותר ולבסוף נשאב לתוך התא האחורי של הלב, שבו המחזור חוזר.
דג הזברה מבוגר יכולה להניח 200 או יותר ביצים בכל פעם, וoncדואר מופרה, שהם מפתחים במהירות 2. בתוך יום אחד ציר הגוף מפותח, כולל שרירים שחוזה ולהעביר את העובר סביב בתוך קרום כוריוני. מ2-7 ימים לאחר הפריה (DPF) רוב מערכות הגוף לפתח, כולל עיניים ומערכת עצבים מרכזיות שיכולים לתאם שוחה לעבר מזון או הרחק מאור בהיר. עד 7 עוברי DPF הם קטנים מספיק כדי לאפשר הדמיה עם מיקרוסקופ. קווים מהונדסים המבטאים את חלבוני ניאון ניתן הדמיה עם מיקרוסקופיה confocal או הקרינה. ההדמיה confocal ניתן לזווג עם תוכנות קוד פתוח 3 כדי ליצור הדמיות 3D של מבני כלי דם מלאים בעוברי דג הזברה המספקים נקודת מבט ביולוגיה מערכות של התפתחות כלי דם. מחקרים העוסקים בשינויים במורכבות כלי דם וכלי דם במוח ייהנו מפרוטוקול זה כפי שהוא מאפשר ניתוח ברמת מערכות של רשתות כלי דם 4,5. אוסף של שיטות ומשאבים הם לספקד, כדי לאפשר אימוץ קל ושל טכניקות אלה ללימודים שדורשים הדמיה של מבני כלי דם בדג זברה עוברית. יעילות העלות של דג הזברה כמודל חיה היא שילוב עם טכנולוגיות הדמיה המתעוררות לספק פלטפורמות חדשות שבה להעריך את השפעות angiogenic של מסלולים מולקולריים בהתפתחות חוליות והומאוסטזיס.
השיטות שתוארו כאן לספק בסיס ללימודים חזותיים של מערכת כלי הדם בפיתוח דג הזברה. דגימות בשידור חי ניתן להשתמש כדי להעריך את פרמטרים פיסיולוגיים, כגון קצב לב ונפח פעימת לב, ואילו דגימות קבועות יכולות לשמש לconfocal הדמיה ברזולוציה גבוהה. דרוזופילה וג elegans לאפשר הדמיה של כל גוף, אבל דג הזברה הן בעלי חוליות ולספק מודל שימושי לרקמות חוליות, כולל מערכת כלי דם מרופד תא האנדותל. מחקרים אלה יכולים לשלב קווים מהונדסים משמעותיים ומשאבים הגנומי מהקהילה מחקר דג הזברה. שחזור 3D ו טיוח של תמונות confocal מדג הזברה עוברית, כפי שתואר כאן, מאפשר גישת ביולוגיה של מערכות להסתעפות של כלי דם וצפיפות כלי דם שאינה אפשרי עם מודלים של בעלי חיים גדולים כמו חולדות ועכברים. יתר על כן, כamniotes דג הזברה מתפתחת בסביבה לשינוי (חיץ E3), שבו אפשר להוסיף בקלות גhemicals המעכבים אנזימים ספציפיים או תהליכים אחרים המשפיעים על התפתחות של כלי דם. הריכוז ועיתוי המשלוח כימי ניתן לשנות, מה שמאפשר לחוקר תנאי טיפול לכוונן.
1. שינויים ופתרון בעיות
שינויים במערכת זו יכולה לשלב קווים מהונדסים של דג הזברה שמבטאים חלבוני ניאון EGFP או אחרים במגוון רחב של דפוסי רקמות ספציפיים, איבר או אזור 10. יתר על כן, ניתוח של שינויי neovascular ברשתית דג הזברה באחרונה פורסם 5. בעיות עם פיגמנטציה בעוברים ודג זברה מבוגרים יותר יכולות להיות מתוגמלות על ידי מעבר עם קווים מהונדסים, שאינו מייצרים פיגמנטים בקנה מידה או פיגמנט של רשתית. בעיות עם הקרינה מופחתת בדרך כלל כתוצאה מתנאי קיבעון לא הולמים. Paraformaldehyde (4%) ליום 1 הוא אופטימלי, אבל fixatives חזק יותר, כגון glutaraldehyde, tetroxide אוסמיום או אלכוהול, עלוללהרוס הקרינה EGFP. לאחר קיבוע, צריך להיות כל הזמן עובר בPBS ב 4 ° C ותמיד מוגן מפני אור שמש ישיר.
2. מגבלות של טכניקה זו
האיכות והרזולוציה של הדמיות 3D מיוצרות עם פרוטוקול זה תלויות באיכות של תמונות שנוצרו. חדירת אור דרך עוברים אלה מוגבלים למישור אמצע sagittal-באמצעות מיקרוסקופ confocal סטנדרטי. היבט זה של הדמיה מגביל את העומק של הדמיה בעוברים ומבוגרים, אבל מערכות מיקרוסקופיה רב פוטון מתקדמות יותר מאפשרות הדמיה בעומקים גדולים יותר.
3. משמעות ביחס לשיטות קיימות
פרוטוקול זה מספק גישה לניתוח של רשתות כלי דם ברמה מערכות שיכולים לשלב כל בעלי חיים. ייצוגים קודמים של נתונים כאלה לעתים קרובות הסתמכו על סדרה של תמונות ערוכים יחד, אבל טיוח 3D מספק רזולוציה טובה יותר של רלה המרחביתtionships מעורב.
4. יישומים עתידיים
פיתוחים חדשים בתחום הדמיה ועיבוד רקמות יספק יישומים חדשים רבים לשיטות אלה, שעשויים לכלול מה שהופך את עוברים או מבוגרים 11-14 שקוף מבוגרים יותר. שקיפות משופרת תגדיל חדירה לרקמות מאוד על ידי לייזרי פוטונים רב confocal ו. יתר על כן, כמו המהירות של מצלמות וצינורות מכפיל להגדיל זה עשוי להיות אפשרי בקרוב לייצר הדמיות 3D של דגים בזמן אמת, ומספק ממד ה -4 של ניתוח.
5. צעדים קריטיים
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא הכנה להדמיה, הכולל קיבוע נכון. הדמיה צריך להיעשות בהקדם האפשרי לאחר קיבוע עם יעדים באיכות גבוהה שיש להם הפתחים המספריים הטובים ביותר הזמינים. החלטה תלויה במערכת ההדמיה משמשת, מערכות איכות כל כך גבוהה הן בדרך כלל טוב יותר. יצירת הדמיות 3D היא זיכרון אינטנסיבילכך מחשבים עם כמות גדולה של זיכרון ומעבדי גרפיקה טובים יותר, high-end מומלץ.
מערכת הביולוגיה החזותית שתוארה כאן כבר מותאמת לדג זברה מהונדס המבטא EGFP בתאי האנדותל של כלי דם, אם כי יכולים להיות מותאמות בשיטות אלה לעוברים מהונדסים המבטאים את ה-GFP, או חלבוני ניאון אחרים, באוכלוסיות של תאי עצב, שרירים, בלוטות או כל מספר של תאים אחרים. היתרון העיקרי בעבודה עם מערכת זו הוא היכולת ללמוד מה שקורה בכל העובר בכל עת במהלך תקופת התפתחותי זה, בבעלי חיים קבועים ו / או בשידור חי.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לחברים בעבר ובהווה של המעבדות שלנו שעזרו לפתח את הטכניקות הללו. מימון חלקי שנמסר לי DE על ידי מענק ממכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית / CIRM (RN1-00538).
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |