Imaging av cerebrovaskulær utvikling i larvesebrafisk er beskrevet. Teknikker for å lette 3D avbildning og endre cerebrovaskulær utvikling ved hjelp av kjemiske behandlinger tilbys også.
Sebrafisk er et kraftig verktøy for å studere utviklingsbiologi og sykdomslære in vivo. Den lille størrelse og relative åpenhet av sebrafisk embryoer gjør dem særlig anvendelige for visuell undersøkelse av prosesser slik som hjerte-og vaskulære utvikling. På flere nyere studier transgen sebrafisk som uttrykker EGFP i vaskulære endoteliale celler ble brukt til å analysere bildet og komplekse vaskulære nettverk i hjernen og netthinnen, ved hjelp av konfokal mikroskopi. Beskrivelser er gitt for å forberede, behandle og bilde sebrafisk embryo som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), og deretter generere omfattende 3D-gjengivelser av cerebrovaskulær system. Protokoller inkluderer behandling av embryoer, confocal bildebehandling, og festeprotokoller som bevarer EGFP fluorescens. Videre er nyttige tips om å skaffe bilder av høy kvalitet av cerebrovaskulære strukturer, som for eksempel fjerning av øyet uten å skade nærliggende nevrale vev gitt. Potensielle fallgruvermed confocal bildebehandling blir diskutert, sammen med de nødvendige skritt for å generere 3D rekonstruksjoner fra confocal bildestakker bruker fritt tilgjengelig programvare med åpen kildekode.
Sebrafisk gi et kraftig system for å studere utviklingsbiologi, og den relative åpenhet av sine befruktede egg er mottagelig for bildebaserte studier en. Sebrafisk har nå blitt brukt som modell for virveldyr utvikling i flere tiår. Teleoster, inkludert sebrafisk, har et forenklet virveldyr karsystemet som ikke har noen rimelig homolog hos invertebrater. Blodet pumpes fra det fremre kammer i en to-kammer hjerte gjennom gjellene, hvor den oksygenerte. Blod fra gjellene konvergerer på dorsal aorta og går gjennom arterier som gren i mindre og mindre fartøy, til slutt nådde kapillærer i orgel vev. Innenfor kapillarer oksygen frigjøres og karbondioksyd er absorbert. På den venøse siden av kapillærene strømmer blod inn i større og større årer, og endelig er trukket inn i det bakre kammer av hjertet, hvor syklusen gjentas.
En voksen sebrafisk kan legge 200 eller flere egg om gangen, og once befruktet, utvikler de fort to. Innen en dag kroppen aksen er godt utviklet, inkludert muskler som kontrakten og flytte embryoet rundt inne i chorionic membran. Fra 2-7 dager etter befruktning (DPF) de fleste kroppens systemer utvikles, inkludert øyne og et sentralnervesystem som kan koordinere svømming mot mat eller bort fra sterkt lys. Opp til 7 DPF embryoer er små nok til å tillate visualisering med mikroskopi. Transgene linjer som uttrykker fluorescerende proteiner kan avbildes med confocal eller fluorescens mikroskopi. Confocal bildebehandling kan pares med åpen-kildekode tre for å lage 3D-gjengivelser av komplette vaskulære strukturer i sebrafisk embryo som gir en systembiologi perspektiv av vaskulær utvikling. Studier som er opptatt av endringer i vaskulær og cerebrovaskulær kompleksitet vil ha nytte av denne protokollen som gjør det mulig for et system nivå analyse av vaskulære nettverk 4,5. En sammenstilling av metoder og ressurser er å gid for å tillate for enkel adopsjon og av disse teknikkene for studier som krever avbildning av vaskulære strukturer i embryonale sebrafisk. Kostnadseffektivitet av sebrafisk som en dyremodell er å kombinere med nye bildeteknologier for å gi nye plattformer med å vurdere angiogenetiske effekter av molekylære stier i virveldyr utvikling og homeostase.
Metodene som beskrives her gi et grunnlag for visuelle undersøkelser av karsystemet i å utvikle sebrafisk. Pågående prøver kan brukes for å vurdere fysiologiske parametre, som hjerte-og hjertefrekvensen slagvolum, mens faste prøver kan brukes for høy oppløsning konfokal avbildning. Drosophila og C. elegans tillate for hele kroppen bildebehandling, men sebrafisk er virveldyr og gi en nyttig modell for virveldyr vev, inkludert en endotelceller-lined karsystemet. Disse studiene kan innlemme betydelige transgene linjer og genomisk ressurser fra sebrafisk forskningsmiljøet. 3D rekonstruksjon og gjengivelse av confocal bilder fra embryonisk sebrafisk, slik det er beskrevet her, gir mulighet for en systembiologisk metode til vaskulær forgrening og blodkartettheten som ikke er mulig med større dyremodeller slik som rotter og mus. Videre, som amniotes sebrafisk utvikle seg i en modifiserbar miljø (E3 buffer), hvor man kan enkelt legge til chemicals som hemmer spesifikke enzymer eller andre prosesser som påvirker vaskulær utvikling. Konsentrasjonen og timing av kjemiske levering kan bli endret, slik at forskeren å finjustere behandlingsforhold.
En. Modifikasjoner og feilsøking
Modifikasjoner på dette systemet kan innlemme transgene linjer av sebrafisk som uttrykker EGFP eller andre fluorescerende proteiner i en rekke vev, organer eller region bestemte mønstre 10. Videre har analyse av neovaskulære endringer i sebrafisk retina har nylig blitt publisert 5. Problemer med pigmentering i eldre embryoer og voksne sebrafisk kan kompenseres ved å krysse med transgene linjer som ikke produserer skala pigmenter eller retinal pigment. Problemer med redusert fluorescens vanligvis et resultat av en festeforhold. Paraformaldehyd (4%) i 1 dag er optimal, men sterkere fiksativ, slik som glutaraldehyd, osmium-tetroksyd-eller alkohol, kanødelegge EGFP fluorescens. Etter fiksering, bør embryo holdes i PBS ved 4 ° C og alltid beskyttet mot direkte sollys.
2. Begrensninger av denne teknikken
Kvaliteten og oppløsningen på 3D-gjengivelser produsert med denne protokollen avhenger av kvaliteten på bildene som genereres. Svak penetrering gjennom disse embryoer er begrenset til det mid-sagittal plan ved hjelp av en standard konfokalmikroskop. Dette aspektet av bildebehandling begrenser dybden av bildebehandling i eldre embryoer og voksne, men mer avanserte multi-foton mikroskopi systemer gir mulighet for bildebehandling på større dyp.
Tre. Betydning i forhold til eksisterende metoder
Denne protokollen gir en tilnærming til analyse av blodkaret nettverk på et systemnivå som kan innlemme et helt dyr. Tidligere fremstillinger av slike data ofte stolt på serie med bilder lagt ut sammen, men 3D-rendering gir bedre oppløsning av den romlige forholdtionships involvert.
4. Fremtidige søknader
Nye utbygginger i bildebehandling og vev behandling vil gi mange nye søknader om disse metodene som kan inkludere å gjøre eldre embryoer eller voksne gjennomsiktig 11-14. Forbedret åpenhet vil øke vev penetrasjon av confocal og multi-foton lasere. Videre, ettersom hastigheten til kameraene og fotomultiplikatorrør øke kan det snart være mulig å frem 3D-gjengivelser av fisk i sanntid, som gir en 4 th dimensjon av analysen.
5. Kritiske trinn
Et kritisk punkt i denne protokollen er forberedelse for bildebehandling, som inkluderer riktig fiksering. Imaging bør gjøres så snart som mulig etter fiksering med høy kvalitet mål som har de beste numeriske åpninger tilgjengelig. Oppløsning avhenger av avbildningssystem benyttes, så høy kvalitet systemer er generelt bedre. Genererer 3D-gjengivelser krever mye minneFor så nyere, high-end-maskiner med en stor mengde minne og gode grafikkprosessorer er anbefalt.
Den visuelle biologi systemet beskrevet her har blitt optimalisert for transgen sebrafisk som uttrykker EGFP i vaskulære endotelceller, selv om disse metodene kan tilpasses transgene embryoer som uttrykker GFP, eller andre fluorescerende proteiner, i populasjoner av nerveceller, muskler, kjertler eller en rekke andre celler. Den store fordelen i å jobbe med dette systemet er muligheten til å studere hva som skjer i hele embryo når som helst i løpet av denne utviklingsperioden, i faste og / eller levende dyr.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker tidligere og nåværende medlemmer av våre laboratorier som hjalp utvikle disse teknikkene. Delfinansiering gitt til DE av en bevilgning fra California Institute for Regenerative Medicine / CIRM (RN1-00538).
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |