Imaging av cerebrovaskulär utveckling i larver zebrafisk beskrivs. Tekniker för att underlätta 3D-avbildning och ändra cerebrovaskulär utveckling med hjälp av kemiska behandlingar finns också.
Zebrafisk är ett kraftfullt verktyg för att studera utvecklingsbiologi och patologi in vivo. Den lilla storleken och den relativa öppenheten i zebrafisk embryon gör dem särskilt användbara för visuell undersökning av processer såsom hjärta och kärl-utveckling. I flera nya studier transgen zebrafisk som uttrycker EGFP i vaskulära endotelceller har använts för att avbilda och analysera komplexa vaskulära nätverk i hjärnan och retina, med användning av konfokalmikroskopi. Beskrivningar finns för att förbereda, behandla och bild zebrafisk embryon som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP), och sedan generera omfattande 3D-renderingar av cerebrovaskulär systemet. Protocols inkludera behandling av embryon, konfokal avbildning, och fixeringsprotokoll som bevarar EGFP-fluorescens. Vidare är bra tips på att få bilder av cerebrovaskulära strukturer, till exempel avlägsnande av ögat utan att skada närliggande nervvävnad av hög kvalitet tillhandahålls. Potentiella fallgroparmed konfokal avbildning diskuteras, tillsammans med de åtgärder som krävs för att generera 3D-rekonstruktioner från konfokala bildstaplar med hjälp av fritt tillgänglig programvara med öppen källkod.
Zebrafisk ger ett kraftfullt system för att studera utvecklingsbiologi, och den relativa öppenheten i deras embryon är mottaglig för imaging-baserade studier 1. Den zebrafisk har nu använts som modell för ryggradsdjur utveckling i årtionden. Benfiskar, inklusive zebrafisk, har en förenklad ryggradsdjur kärlsystemet som inte har någon rimlig homolog i ryggradslösa djur. Blodet pumpas från den främre kammaren i två kamrar hjärta genom gälar, där det är syresatt. Blod från gälarna konvergerar vid den dorsala aorta och passerar genom artärerna som gren i mindre och mindre fartyg når slutligen kapillärerna i vävnader orgel. Inom kapillärer syre frigöres och koldioxid absorberas. På den venösa sidan av kapillärer blod flödar in i större och större vener och slutligen dras in i bakre kammare i hjärtat, där cykeln upprepas.
En vuxen zebrafisk kan lägga 200 eller fler ägg i taget, och ONCe befruktade, utvecklar de snabbt 2. Inom en dag kroppsaxeln är väl utvecklad, inklusive muskler kontraktet och flytta embryot runt inne i chorionic membranet. Från 2-7 dagar efter befruktningen (DPF) de flesta kroppssystemen utvecklas, bland annat ögon och ett centralt nervsystem som kan samordna simma in mot mat eller borta från starkt ljus. Upp till 7 dpf embryon är tillräckligt små för att möjliggöra visualisering med mikroskopi. Transgena linjer som uttrycker fluorescerande proteiner kan avbildas med konfokal eller fluorescensmikroskopi. Confocal avbildning kan paras ihop med öppen källkod 3 för att skapa 3D-renderingar av kompletta kärlstrukturer i zebrafisk embryon som ger en systembiologi perspektiv av vaskulär utveckling. Berörs av förändringar i kärl-och cerebrovaskulär komplexitet studier kommer att gynnas av detta protokoll eftersom det möjliggör en systemnivå analys av vaskulära nätverk 4,5. En sammanställning av metoder och resurser gerd för att möjliggöra enkel antagande och av dessa tekniker för studier som kräver avbildning av vaskulära strukturer i embryonala zebrafisk. Kostnadseffektiviteten för zebrafisk som en djurmodell är att kombinera med nya avbildningstekniker för att tillhandahålla nya plattformar för att mäta de angiogena effekter av molekylära vägar i ryggradsdjur utveckling och homeostas.
De metoder som beskrivs här ger en grund för visuella studier av kärlsystemet utveckla zebrafisk. Levande exemplar kan användas för att bedöma fysiologiska parametrar såsom hjärtfrekvens och hjärtslagvolymen, medan fasta prover kan användas för hög upplösning konfokala avbildning. Drosophila och C. elegans möjliggöra hela kroppen avbildning, men zebrafisk är vertebrater och ger en användbar modell för ryggradsdjur vävnader, inklusive en endotelcell-fodrade kärlsystemet. Dessa studier kan innehålla betydande transgena linjerna och genresurser från zebrafisk forskarsamhället. 3D-rekonstruktion och rendering av konfokala bilder från embryonala zebrafisk, som beskrivs här, möjliggör en systembiologisk metod för kärl förgrening och blodkärlstätheten som inte är möjligt med större djurmodeller såsom råttor och möss. Vidare, som amnioternas zebrafisk utvecklas i en modifierbara miljö (E3-buffert), där man kan enkelt lägga till chemicals som hämmar specifika enzymer eller andra processer som påverkar vaskulär utveckling. Koncentrationen och tidpunkten för kemisk leverans kan ändras, gör det möjligt för forskare att finjustera behandlingsförhållanden.
1. Ändringar och felsökning
Modifieringar av detta system kan införliva transgena linjer av zebrafisk som uttrycker EGFP eller andra fluorescerande proteiner i en variation av vävnad, organ eller regionspecifika mönster 10. Vidare har analys av neovaskulära förändringar i zebrafisk näthinnan nyligen publicerats 5. Problem med pigmentering i äldre embryon och vuxna zebrafisk kan kompenseras genom att korsa med transgena linjer som inte producerar skal pigment eller retinal pigment. Problem med minskad fluorescens resulterar vanligtvis från olämpliga fixeringsförhållanden. Paraformaldehyd (4%) under en dag är optimal, men starkare fixativ, såsom glutaraldehyd, osmiumtetroxid eller alkohol, fårförstöra EGFP fluorescens. Efter fixering, bör embryon förvaras i PBS vid 4 ° C och alltid skyddas från direkt solljus.
2. Begränsningar av denna teknik
Kvaliteten och upplösning 3D-renderingar produceras med detta protokoll är beroende av kvaliteten på bilderna som genereras. Ljuspenetrering genom dessa embryon är begränsad till sagitalplan med en vanlig konfokalmikroskop. Denna aspekt av bildbehandling begränsar djupet av bildbehandling i äldre embryon och vuxna, men mer avancerade multi-foton mikroskopi system möjliggör avbildning på större djup.
3. Betydelse med avseende på befintliga metoder
Detta protokoll ger en metod för analys av blodkärlsnätverk på systemnivå som kan innehålla en hel djur. Tidigare representationer av sådana uppgifter förlitat ofta på bildserie som ut tillsammans, men 3D-rendering ger bättre upplösning på den rumsliga förhållandetioner inblandad.
4. Framtida applikationer
Ny utveckling inom bildbehandling och vävnadsbehandling kommer att ge många nya applikationer för dessa metoder som kan inkludera att göra äldre embryon eller vuxna transparent 11-14. Ökad öppenhet kommer att öka vävnadspenetration genom konfokala och multifoton lasrar. Vidare, eftersom hastigheten på kameror och fotomultiplikatorrör ökar kan det snart vara möjligt att producera 3D-renderingar av fisk i realtid, vilket ger en 4: e dimension analys.
5. Kritiska steg
Ett kritiskt steg i detta protokoll är förberedelse för avbildning, vilket inkluderar ordentlig fixering. Undersökningen bör göras så snart som möjligt efter fixering med hög kvalitetsmålen som har de bästa numeriska öppningar tillgängliga. Upplösning beror på avbildningssystem som används, så högkvalitativa system är i allmänhet bättre. Generera 3D-renderingar är minneskrävandeför så nyare, high-end datorer med en stor mängd minne och goda grafikprocessorer rekommenderas.
Den visuella biologi systemet som beskrivs här har optimerats för transgena zebrafisk som uttrycker EGFP i vaskulära endotelceller, även om dessa metoder kan anpassas till transgena embryon som uttrycker GFP, eller andra fluorescerande proteiner, i populationer av nervceller, muskler, körtlar eller valfritt antal andra celler. Den stora fördelen av att arbeta med detta system är möjligheten att studera vad som händer i hela embryot när som helst under denna utvecklingsperiod, i fasta och / eller levande djur.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar tidigare och nuvarande medlemmar i våra laboratorier som hjälpt till att utveckla dessa tekniker. Partiell finansiering till DE genom ett anslag från California Institute för regenerativ medicin / CIRM (RN1-00.538).
N – Phenylthiourea | Alfa Aesar, catalog #41972 | 0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC | |
E3 buffer | Sigma | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Confocal microscope | Nikon | D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U | |
Glass bottom dishes | Mat-Tek | ||
GSI IX/DAPT | N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences | ||
24 well plates | Becton-Dickinson, cat# 351147 | BD Falcon | |
Transfer pipettes | VWR, cat #414004-001 | VWR disposable transfer pipets | |
Methyl-cellulose | Alfa Aesar, cat#43146 | 3% in E3 buffer | |
NRD 4/6 Fish food | Brine Shrimp Direct | Dried | |
Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | Live | |
Tungsten wire | Small Parts # TW-016-60 | 0.016” OD | |
Tricaine | VWR # 101107-950 | Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer |