重组脂膜的结构和功能研究的钾离子通道
Summary
完整的原型脂膜的电压门控钾离子通道进入重组程序中描述的。重组的渠道都适合生化检测，电气录音，配体筛选和电子晶体学研究。这些方法可以有其它膜蛋白的结构和功能研究的一般应用。
Abstract
若要研究的脂质在一个还原论的的时尚的 – 蛋白相互作用，它是必要的，，以纳入成定义良好-的的脂质组合物的膜的的的膜蛋白。我们正在研究在了一个原型电压-门控性钾（Kv值）信道中的脂质-依赖的的的门控效果，，，，并已摸索出到不同的膜系统中的的详细程序，以重新组建的渠道。我们的的复溶程序也须花上代价为两个的囊泡的以的洗涤剂-诱导的的的融合菜式，和的融合菜式的与的脂质/界面活性剂的混合胶束的的蛋白质/去污剂微胶束中，以及作为在的重要性的的脂类达成一项平衡态分布产生的蛋白质/清洁剂/脂质和的洗涤剂/脂质的混合的胶束。我们的的数据所表示的，在的油脂泡囊中中的信道的插入的是相对地在取向中随机抽出的，，，并，没有可检测到的蛋白质聚集体被在分馏实验中看到的，了复溶效率是如此之高的。我们已动用了重新组建，，以确定在不同的脂类中的的渠道的构象状态的d个频道，请记录一个小的数目间在平面脂双层膜的中注册成立之的信道，屏幕为从一个噬菌体-显示的的的的肽库的构象-特定的的配体的电活动的，，并支持的增长的二维晶体的：在膜的中的信道。可适于在脂质双层中，特别是对于真核电压门控离子通道的脂质的影响的调查研究其他膜蛋白的重组此处描述的步骤。
Introduction
的细胞交换与他们的的环境中的材料和信息通过特定的的膜蛋白1的职能，。在细胞膜上的膜蛋白的功能作为泵，渠道，受体，膜内内切酶器，连接器和跨膜的的的结构性支持者。影响的膜蛋白的的的基因突变，已一直与到许多的人类疾病的有关。事实上，有很多的的膜蛋白已经一直的首要的的的的药物靶标，，，因为他们顷重要的的，和很容易在单元格膜的访问的。因此，很重要的是了解膜不同的膜蛋白的结构和功能，并使得有可能设计新颖的方法，以减轻从突变蛋白在人类疾病中的不利影响。
脂质环绕所有集成在双层膜2，3的膜蛋白。在为真核细胞膜中，的各种的脂类的不同类型的顷公知，以被组织成的微区4，5。的许多的膜蛋白被示出将予分派产生这些的微区，以及作为了笨重的的的的膜心情，6的流体相为。该机制，背后的组织的的膜蛋白的的的的微区和的交付融入其中，的生理意义该等分派之的的是显然是重要的，，，，但仍然不佳理解的。的一个主要的在研究膜蛋白的的上的血脂特效时的的技术难度是生物化学上纯化的膜的成有良好对照的的的脂质组合物的膜的的蛋白质其他，以便，几乎所有的重新配制的蛋白质顷功能性的7的的可靠的复溶的。在的过去的的的几年里中，我们开发的方法的去重构一个从A.的“电压-门控性”原型钾离子通道pernix的 （KvAP）成各种膜系统的结构和功能研究8-10。其他人的数据，我们一起显示，脂类可能是一个决定因素中的构象变化的电压检测的一个电压门控离子信道和的网域可能会塑造的这些信道11中的的一些的的的结构。在未来，我们将提供我们的方法的详细说明，并提供关键技术的提示，可能会确保我们的研究结果，以及我们的方法扩展到其他膜蛋白的研究成功再现。
Protocol
Representative Results
Discussion
8-10在几项研究中已被用于重建成不同的膜的KvAP频道。去污剂/脂质混合胶束和蛋白/去污剂/脂质的混合胶束之间的脂质确保分布的想法，我们能够达到几乎完全重构的KvAP制成的非常不同的脂质膜。每个四聚KvAP通道需要〜100脂质分子完全覆盖其跨膜结构域。的基本要求，是让足够的脂质分子融合蛋白/类脂/洗涤剂胶束前去除洗涤剂。确保我们的标准条件（0.5毫克的蛋白质和5.0毫克脂类）平?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
江实验室KvAP的研究已取得显着的帮助罗德里克麦金农博士在洛克菲勒大学的实验室。特别要感谢博士Kathlynn布朗和迈克尔McQuire的建议和帮助我们噬菌体屏实验。这项工作是由美国国立卫生研究院（GM088745 GM093271 Q-XJ）和AHA（12IRG9400019 Q-XJ）的补助支持。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Yeast Extract | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatin A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| NeutrAvidin agarose beads | Piercenet | 29200 | |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentane | Fisher | R399-1 | |
| Decane | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
References
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