ゼブラフィッシュ幼虫ルシフェラーゼレポーターシステムを用いたグルココルチコイドシグナル伝達のための化学スクリーニング法

Summary

グルココルチコイド応答インビボゼブラルシフェラーゼ活性（GRIZLY）アッセイ：私たちは、ゼブラフィッシュの幼虫を使用したグルココルチコイドストレスホルモンのシグナル伝達のための化学スクリーニングシステムの手順とデータ解析について説明します。アッセイは、高感度かつ特異的に代謝を必要とするか、内因性のグルココルチコイドの産生に影響する化合物によってグルココルチコイドシグナル伝達への影響を検出します。

Abstract

グルココルチコイドストレスホルモンおよびそれらの人工的誘導体は、広く炎症を治療する薬剤を用いているが、グルココルチコイドによる長期治療は、重篤な副作用をもたらすことができる。試験系は、in vivoでのグルココルチコイドシグナル伝達に影響を与える新規な化合物を探索するか、またはグルココルチコイドシグナル伝達経路に対する化合物の望ましくない効果を決定するために必要とされる。我々は、 生体内でリアルタイムでグルココルチコイドシグナル伝達活性を測定することができるトランスジェニックゼブラフィッシュアッセイを確立している、GRIZLYアッセイ（グルココルチコイド、生体ゼブラフィッシュルシフェラーゼ活性の応答）。ルシフェラーゼに基づくアッセイは、代謝を必要とするか、内因性のグルココルチコイドの生産に影響を与える化合物による影響を含め、高感度と特異性を有するグルココルチコイドシグナル伝達への影響を検出します。ここでは、このアッセイと化学スクリーンを行うための詳細なプロトコルを提示する。我々は、データ収集、正規化などを記述する分析、品質管理およびデータの可視化に焦点を置く。アッセイは、単純な、時間分解、および定量的な読み出しを提供しています。それは、スタンドアロンのプラットフォームとして動作させることができるだけでなく、容易にハイスループットスクリーニングのワークフローに統合される。それはさらに、このような内分泌かく乱物質やストレス研究の環境モニタリングなどの化学スクリーニングを超えて多くのアプリケーションを可能にする。

Introduction

グルココルチコイド（GCS）は、ストレス応答時の代謝¹の調節に重要な役割を果たしている副腎によって生成ステロイドホルモンである。 GCは、結合した際に、核内に移行²核内受容体スーパーファミリーの細胞質コルチコイド受容体（GRS）をバインドします。ここでは、それらは例えば、他の転写因子（トランスリプレッション）に干渉することにより転写を抑制またはグルココルチコイド応答エレメント（GRE、トランス）を介して遺伝子転写を活性化することができる。に起因するそれらの抗炎症特性、天然および人工の両方のGCは、喘息やリウマチ³など多くの疾患の治療に広く使用されている薬物である。しかし、GCは、特に長期使用は、糖尿病および緑内障⁴を含む、重篤な副作用をもたらし得る。したがって、潜在的に有益な処理効率および忍容性とシグナリングGCを標的とする新規化合物は後方に非常に求められているER。重要なのは、培養した細胞で観察されたリガンドの効果は、生体 ⁵ に見られるものとは異なる場合があります。このような効果は、従来の細胞培養で得られた結果は、バイアス薬学的スクリーニングアッセイをもとかもしれない。それは、細胞培養^6,7は検出できない効果を決定することができるようにゼブラフィッシュのモデルでは有効な化学的、生体内スクリーニングは最近、焦点になってきた。

ホルモンのシグナル伝達経路は、環境汚染物質の影響を受けることができる。いわゆる内分泌かく乱化学物質（EDC）は、様々なホルモン規制プロセス⁸に影響^を与える。このように、再生及び水生生物の性分化は、エストロゲン様活性を有する物質によって調節することができる。最近では、懸念は代謝障害、環境⁹でのEDCsにリンクされるかもしれない提起されている。このような「代謝混乱」の対象となる一つの経路はまた、異種に関与しているグルココルチコイド経路であり、開発や免疫機能^10,11に対する抗生作用。しかし、性ステロイドホルモンの作用を妨害化合物で利用可能な大量の情報と比較して、比較的少ないがGRを介して媒介内分泌かく乱作用については知られている。そのため、ツールは、生体内でのGCシグナルに汚染物質の影響を監視できるようにすることが必要である。

ゼブラフィッシュは、長い発生生物学における人気モデルされており、さらに最近ではまた内分泌学¹²を含む他の分野の研究者を集めている。多くの他の魚種^13-15における重複受容体とは対照的に、ゼブラフィッシュのゲノムは1つのGR遺伝子を含有するので、他の硬骨魚類と比較して、ゼブラフィッシュのGCシグナル伝達系は、哺乳動物のものと類似している。加えて、視床下部-下垂体-副腎軸はストレスに応答して内因性のGC産生を増加させる5日齢の幼生ゼブラフィッシュ、既に機能している^14,16-18。

リュック、 生体内で 、リアルタイムでの¹⁸のGCシグナル伝達活性をモニターすることができます：我々は最近、トランスジェニックゼブラフィッシュライン、GREを生成している。ラインは、最小TATAボックスプロモーターの制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子構築四GREのコンカテマー（ 図1a）を運ぶ。 GC誘発される生物発光は、単一のGREから測定することができます。長期間にわたって生体内で 96ウェルマイクロタイタープレート内のリュックの幼虫。 （「グルココルチコイド応答の生体内ゼブラルシフェラーゼ活性」の場合）、このGRIZLYアッセイは、このようなストレスの研究、環境モニタリング、および薬理学スクリーン¹⁸の異なる研究分野の数で使用することができます。我々は、単一の幼虫から浸透圧ストレス後のコルチゾールにおける内因性の上昇を検出することができたし、開発中の応答の成熟をたどることができます。さらに、我々は、有機スズのGCシグナル伝達に対する効果をモニターすることができ幼虫による代謝を必要とするS。重要なことに、線は、環境的に適切な濃度でこれらの効果を検出することができた。最後に、パイロットの画面でアッセイは、高感度かつ特異的に幼虫における内因性コルチゾールの産生を刺激した1つの化合物を、化学ライブラリからのGC活性を有する化合物を検出した。ここでは、GRIZLYアッセイを用いて化学スクリーンのための詳細なプロトコルを記載している。

Protocol

1。化合物ライブラリーのワーキング希釈液を調製試験対象の薬剤ライブラリの化合物を事前希釈ロボット液体ハンドリングステーション（ 例えばマルチプローブII、8針を持つのE3（5のNaCl、0.17のKCl、0.33のCaCl 2）に（ 例えば FDAは医薬品、ENZOライフサイエンスを承認しました）処分チップ·アダプタ、パーキンエルマー）。適切な濃度は、3％DMSO中で、例えば 40μg/ mlのであるが、これは使用するライブラリのタイプに依存する。以下に説明されたステップに対応するマルチプローブIIの設定は、 表1に示す。表に記載されたプロトコルは、並列の4つのアリコートをプレートの調製を可能にする。 ディープウェルプレート（ 例えば 96ウェル保存プレート、ラウンドまあ、0.8ミリリットル、ABgene）への株式ライブラリ（DMSO中2 mg / ml）をピペット10μlアリコート。列1および12は空のままにしておく必要が – これらは、正と負の内プレートのコントロールが表示されます。 <l私は>マルチプローブIIでライブラリの準備アリコートに1％のDMSOをE3の490μLを分注する。希釈は、処分のヒントなしで固定針を用いて行われる。 内プレートコントロールとして列1および列12（DMSO中）5 mMのデキサメタゾン溶液10μlに10μlのDMSOを加える。すべてのウェル中のDMSOの濃度は、陽性対照ウェル中のデキサメタゾン濃度はE3 / 3％DMSOで100μMであり、現在は3％である。 DMSO性接着封止シートでプレートをシール。使用法まで-80℃でプレートを保管してください。 2。レポーター魚の飼育リュックトランスジェニックフィッシュ：GRE間のグループ交配の自然産卵からの胚を収集します。胚を上げる28℃のインキュベーター内で4日後に受精（DPF）まで、殺菌剤メチレンブルーの1 mg / mlのを補足したE3培地を含む9センチメートルペトリ皿中（60以下）定期的にE3のメディアを変更します。 ルシフェラーゼ中のタイトル "> 3。準備（E3L） ルシフェリン粉末を含有するバイアルにのdH 2 Oを追加することによって、50 mMの水溶液ルシフェリン原液を準備します。このストック溶液を、数ヶ月間-80℃で保存することができる。 E3L媒体を得ることを0.5mMの最終濃度にE3培地にルシフェリンストックを希釈する。 4。 96ウェルプレートに幼虫を配布先端部の約5ミリメートルを遮断し、簡単にシャープなエッジを燃えることにより、広いボア付き1ミリリットルピペットチップを準備します。 慎重にビーカーにペトリ皿からそれらを注ぐことで、いくつかの交雑からプールの幼虫。優しくふるい（0.25ミリメートル径の細孔サイズ）上にそれらを注ぎ、すぐにE3L媒体で満たされた小さなペトリ皿（直径5.5センチメートル）にふるいを配置することにより、一度に収穫は約50幼虫。 ワイドボアピペットチップで、白のウェルに1幼虫をそれぞれ含む培地225μLを転送96ウェルプレート（をOptiPlate、パーキンエルマー）。 粘着シールシート（ 例えばトップシール-A、パーキンエルマー）でプレートをシールし、一晩28℃でそれらをインキュベートする。このプレインキュベーションはすぐにルシフェリン、培養細胞19にも発生する現象を添加した後、生物発光の過渡的変化の記録を防止します。 5。薬物治療 -80℃の冷凍庫で約4時間使用前からライブラリの作業希釈を含むプレートを取り外します。優しくプレートをボルテックスし、簡単にプレートの底に液体を回収するために遠心分離機でそれを回す。 幼虫プレートから接着剤、シールシートを取り外します。 手動96チャンネルピ ​​ペット装置（ 例えば清算、スタインブレナー）で上下に3回薬液をピペット。そして、上の例で幼虫を含むウェルに一定分量の化学ライブラリの使用希釈液25μlを（この0.3％DMSOとE3で4μg/ ml）を、最終濃度をもたらす。ライブラリプレートあたり幼虫をレプリカプレート：10（5最小値）を準備します。 粘着シールシートでプレートをシールし、バーコード·ステッカーを各プレートにラベルを付ける。 6。発光録音強化された発光感度（パーキンエルマー）とエンビジョンの生物発光リーダーの積層単位に幼虫を含むプレートを置く。あるいは、そのようなリーダーと組み合わせて哺乳動物細胞培養スクリーニングシステムのために使用されるようなロボット化インキュベーターシステムを使用。 エンビジョンプレートリーダーについて表2に記載したものと類似のリーダー設定を使用して二日間のレコード生物発光。必要な上映時間と一致するように、実行中のプレートの数に検定リピートの数を適応させる。 実行終了後、COMPの一般毒性を評価するために、死んだ幼虫の存在を、プレートをチェックounds。 7。データ解析すべてのデータ分析は、カスタムスクリプトを使用して、統計的プログラミング環境Rで行われる。 AUCの計算関係なく、動力学的特性のシグナリングGCを活性化する化合物を同定するために、スクリーニングパラメータとして記録された発光トレース（生物発光生カウント対時間）曲線（AUC）下の面積を決定する。 AUCは台形則（ '図2aおよびA参照 ）で近似している。 正規化データの正規性が高い（ 図2bおよび b '）を確保するために、AUCの値を変換ログ。次に、（20を参照）、堅牢Zスコア法を用い、各ライブラリのプレートのログ変換したAUC値を正規化。この正規化は、全てのデータ点の中央値からの標準偏差の数を表す値が得られる。このように、このようなインターランの変動などの系統誤差は、データから削除されます。データは、現在の各ウェル（ 図2cにおよび c '）のための複製の平均ロバストZ-スコアをプロットすることにより視覚化することができる。 品質メトリクスヒートマップ gplotはパッケージ21のheatmap.2機能例えば使用してヒートマップとして各プレートについてのデータをプロットし、プレート関連の影響を可視化するために。このようにして、エッジ効果または化合物のキャリーオーバーを容易に（ 例えば 3bに図3aを比較のこと）を検出することができる。さらなる分析から次善のプレートを除外します。 ROC曲線アッセイの感度および特異性を決定するために、7.2（ 図3c）で決定したZスコアの値を使用してのROC BioConductorのパッケージ22の助けを借りて、特性（ROC）曲線などを受信者動作を計算します。その後、このCuをAUCを決定RVE。 1に近いAUC値は、アッセイの高感度と特異性を示している。 識別を打つ活性化合物を同定するためのカットオフ値を最適化するには、ヨーデンインデックスを決定。インデックスを計算するために、堅牢なZ-スコアカットオフ値を増加させるためのROC曲線の偽陽性率（FPR）から推定真陽性率（TPR）を減算する。カットオフポイントとして最高ヨーデン指数（TPRマイナスFPR）を備えた堅牢なZスコアを取る。 TPR / FPRは、陽性対照ウェルのまたはライブラリ内の既知の活性化合物の検出によって推定することができる。使用する場合は陽性対照ウェルは彼らが予想されるヒットの強さと一致していることを確認してください。 8。再試験上記と同じ記録のセットアップを使用して、異なる供給者から得られた化合物の段階希釈で幼虫を処理することにより、正のヒット化合物を再評価。真のヒットは、発光aを誘導するはずである理想的には、用量依存的に、このアッセイにおいてLSO。

Representative Results

以前の刊行物18には、GRIZLYアッセイの性能を評価するために、パイロット画面640 FDA承認薬のライブラリーをスクリーニングした。このライブラリは、それによって私たちは、アッセイの感度および特異性に関する品質の測定量を決定することができ、12 善意のGCが含まれていました。 図2は、この画面から採取した生データ解析及び正規化の典型的な例を示している。デキサメタゾンコントロールウェルからの典型的な結果は、データが与えられた時間情報を示す、 図2aに示されている。治療はゆっくりと、測定の次の36時間かけて減少した後、約12時間後に発生した生物発光のピーク。 図2aは、「台形法を用いて、AUCの値の近似値を強調しています。この計算は、すべてのウェルと、各技術的反復のために行われる。対数変換の結果は、 図2bに示されている</強い>とB '。ここでは、正の対照の平均は、通常のQQプロットにプロットされている。対数変換は、赤色の対角線で示され、理論値に正規分布したデータ点の大きな近似をもたらす。データの正規性を達成するための変換は、その後の分析の統計的検出力を増加させる。最後に、 図2cおよび2cは、「プレート間の変動にロバストなZ-スコア正規化の効果を示す：別のプレート（ 図2c）で得られた異なるベースライン値は、 図2cにおけるロバストZ-スコアプロットに正規化される」。 ロバストZ-スコア値は、プレートを横切るヒットの分布を可視化することによりデータの系統的エラーを識別するために使用することができる。 図3aは、ロバストZ-スコアvalのライブラリープレートのヒートマップの一例を示しているUEは、井戸の位置に色分けされたプロットされている。一つは、簡単に内プレートポジティブコントロールで列12を識別します。正スコアリングライブラリー化合物は、弱いとはいえ、E2。 図3bは系統誤差が存在するプレートを示し、十分にF8キーで見られるとしている。一つは、複数の列にわたって列AとEのZスコア値の減少に伴って一連の化合物を観察する。これらのウェル中の化合物のいずれも、再テストで陽性反応を示しませんでした。この減少GRIZLY試験活性を有するウェルライブラリープレートに小分けするときにピペッティングロボットが取る経路に沿って配置されているので、このパターンは、自動ピペッティングプロセスの間、正の化合物のキャリーオーバーの指標である。 一緒にライブラリー内の既知のGCの存在下でロバストZ-スコア正規化は、スクリーン18のための受信者動作特性（ROC）曲線を計算することができた。 図3cは、推定のプロットを示す別の堅牢なZスコアのカットオフ値の推定偽陽性率に対する真陽性率を交配。推定真陽性率は、与えられた堅牢なZスコアのカットオフ値で発見されている（ここでは、ライブラリーに存在する既知のグルココルチコイド）真陽性ヒットのパーセントとして定義される。対応する推定偽陽性率は、このカットオフ値で打撃非正の化合物の割合を示しています。この曲線のAUCは、スクリーンと優れたアッセイ性能の高い感度と特異性を示し、0.95である。 AUC曲線は、異なるロバストZ-スコアのヨーデン指標を算出することにより、ヒットの同定のための最適なカットオフ値を推定するために使用した。我々は、最高ヨーデン指標を有すると1.49のロバストZ-スコアを同定した。このカットオフ値は、化合物のバルクからヒットを分離する黒線として図2c」で示されている。 我々の画面で図18は 、我々は、ライブラリーに存在するほぼ全ての既知のGCを識別することができた。わずか12 善意の GCをの3は検出されなかった。この化合物ライブラリーで使用されるものより高い濃度での再試験において陽性反応を示したので、酢酸メレンゲストロールの場合、これは、偽陰性所見であった。他の2 GCは再検査でも陰性であった。プロドラッグプレドニゾンは幼虫システムによってうまく代謝されないかもしれないがコルチコステロンは、げっ歯類での主要なGCではなく、魚やヒト1。興味深いことに、GCのような注釈が付けられていない2つの薬は1が再テスト（スピロノラクトン、ミネラロコルチコイド受容体拮抗薬）で確認できなかったのは、画面で確認された。他の化合物、プレグネノロンは、副腎によってコルチゾールに変換され、ステロイドの生合成における前駆体である。実際に、プレグネノロンでの処理は、幼虫18内のコルチゾールの産生を刺激した。全てのこれらの結果は、高パーフォレーションを確認アッセイのormance：のみ1偽陰性と1偽陽性化合物が、一次スクリーニングの結果の中にあった、とGCシグナル刺激活性を持つ11が確認された化合物の10は、すでに一次スクリーニングで同定された。 図1アッセイおよびスクリーニング手順のワークフローの一般的な原理であって、a）GRIZLYアッセイレポーター構築物の図式。ルシフェラーゼ（イエロー）の発現は、リガンド活性化GRホモ二量体（GR、青）によって結合される最小プロモーター（P minと、オレンジ色）と4つのコンカテマーGREエレメント（（GRE）4、白）によって制御される。赤いボックスは、ゲノムへの構築物の組込みを容易にTol2のトランスポザーゼ部位を示す。ピンクのボックスには、ポリアデニル化サイト（PA）を表している。この詐欺を有するトランスジェニック幼虫構造体は、生物発光測定のために不透明な96ウェルマイクロタイタープレートに配置されている。b）はルシフェラーゼ反応のスキーム。ルシフェラーゼは、発光（hνが）につながる、オキシルシフェリンルシフェリンの酸化を触媒する。反応はまた、幼虫によって提供されるATPおよびMg 2 +を必要とする。画面のPP I、ピロリン。C）ワークフロー。作業用ストック希釈液から調製されたFDAは、1列が（DMSOのみ、緑）およびポジティブコントロール（デキサメタゾン、赤）（ライブラリ設計）を含む1列コントロール内プレートネガを含む、96ウェルプレートに薬剤ライブラリを承認した。 GRE：リュック幼虫を96ウェルプレートに分配（5-11が複製）およびライブラリー化合物（薬物適用）で処理する。生物発光トレースは二日間生物発光リーダー（データ収集）で記録されている。生物発光トレースはnormali（、（AUC計算）統合されている形質転換され、堅牢なZスコアが正規化ログzation）。正規化データは、品質メトリックを決定するために、ヒット識別（データ分析）のために使用される。選択されたヒットは、アッセイ（再試験）の用量依存的活性について再試験されています。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図2。データ解析は、薬物ライブラリーをFDA承認の画面からのデータで示される。 A）よく陽性対照。A '）からの代表的なトレースは曲線下面積（AUC）は、台形公式で近似する。計算に用いた台形は、赤色の異なる色合いに示されている。b）は対数変換前の陽性対照ウェル（y軸）の生のAUC値、対、標準正規母集団（x軸）の通常のQQプロット。b 'は）通常のQQのログ変換後のAUC値をプロットした。正規分布は、対数変換されたデータ点の線形性により示される。ログc）のプロットが画面に試験した全ての化合物についての生データを変形させた。青、 善意のグルココルチコイド、。堅牢なZスコアの正規化後の画面データのグレー、他のすべての化合物C '）プロット。このようなプレート間のばらつきなどの系統誤差は、データから削除されています。赤い線は、正の内プレートのコントロールの平均±SEMを示す。黒線：ヨーデン-インデックスの最適化（ 図3）によって決定された識別カットオフ値をヒット。 14、2012 ACSから許可を得て複製。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 0439fig3.jpg "/> 図3。スクリーニング結果。スクリーン結果のa）のヒートマップ。ライブラリー化合物の強固なZスコアの値は、各ウェルの位置にプロットされる。列12における陽性対照だけでなく、井戸、F8とE2の2つの正のヒット化合物が表示されます。分注ロボットでライブラリ調製の間に正の化合物のキャリーオーバーを示すプレートのB）ヒートマップ。活動の勾配は、ロボットが撮影した分注パスに沿って表示されている。C）受信機は、画面用の特性（ROC）曲線を操作する。推定された真の陽性率（左y軸）と偽陽性率（x軸）はロバストZ-スコアカットオフ値（カラーコード化され、右側のy軸）を増加させるためにプロットされている。結果の曲線のAUC値は、良好なアッセイ性能を示し、1に近い。 14から許可を得て複製、YELLO（活性化合物を示した2012年のACS。D）表一次スクリーニング（prim.）または再試験におけるW）または非アクティブ（青）。 善意のグルココルチコイドは常に（白）再テストされませんでした。 14、2012 ACSから許可を得て再描画。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 一般的な設定： ステップ1.1 手順 タイプ： 単一の液体モード： 吹き消す吸引あたりの分注： 1 速度を最適化： はいエアギャップシステム： 10μL トランスポート： 0 同一平面/ウォッシュ いいえ 吸引物 設定のタイプ 値 備考 ポジション B7、B10、B13、B16 吸引除去巻 10μL スピード 200μL/秒液体の追跡 60％ 吸引高さ実験器具のデフォルト 22.28 ディスペンス 設定のタイプ 値 備考 体位 D7、D10、D13、D16 集を分注する。 10μL スピード 200μL/秒液体の追跡 100μL 高さを分配実験器具のデフォルト 17.01 ステップ1.2 手順 タイプ： 試薬 モード： 廃棄物吸引あたりの分注： 3 速度を最適化： はいエアギャップシステム： <td colspan= "2"> 15μL トランスポート： 0 同一平面/ウォッシュ いいえ 吸引物 設定のタイプ 値 備考 ポジション A4 吸引除去巻 3×490μL エアギャップ 15と0 スピード 200μL/秒液体の追跡 400％ 吸引高さ液面 ディスペンス Sの種類 etting 値 備考 ポジション D7、D10、D13、D16 集を分注する。 490μL エアギャップ 15と0 スピード 200μL/秒液体の追跡 100パーセント高さを分配実験器具のデフォルト 17.01 表1。マルチプローブIIの設定を行います。表1のプロトコルは、4枚（各96穴）の調製を記載する。プレートはロボット（ 例えば 、B7、B10、B13、B16）で指定された位置に作業領域にプレートアダプタに配置されています。 1 "FO：キープtogether.withinページ="常に "> 一般的な設定： 検定リピート数 ランの長さに依存 プレートの数無制限の温度制御 28℃ プロトコル 計算 米国ラム96（CPS）読み込む 測定時間 2.5秒クロストーク補正プレートと検出器の間の距離 0ミリメートルグロウ（CT2）の補正係数 0％ コンテンツ"> 画面に使用する表2。エンビジョン設定。

Discussion

ここではGRIZLYアッセイ^18を用いてインビボで GC活性を測定する化学画面用のワークフローとデータ分析を提示する。アッセイは、従来の細胞ベースのスクリーニング、ハイスループット設定での使用のための重要な利点に匹敵する品質管理特性及び性能尺度を有する。また、しかし、in vivoアッセイはまた、 インビトロの画面にアクセス可能ではない化合物を検出します。これは、ヒットのうち、プロホルモンプレグネノロンの存在が挙げられる。従って、GRIZLYアッセイはGCシグナル伝達活性を目的としたスクリーンの範囲を拡張する。

我々のアッセイでのインビボ効果の検出の重要性は、また、我々は、有機スズ汚染のDBTおよびTBT ¹⁸で得られた結果により示される。 DBTはなく、TBTは、哺乳動物細胞培養においてGCシグナル伝達を阻害することが示されている、と我々はゼブラフィッシュ発現する細胞培養物を観察し、同じGREをING：Lucレポーター。それは幼虫の代謝によってDBTに変換することができるように重要なのが、GRIZLYアッセイにおいて、TBTは、GC経路に対する阻害活性を示した。この阻害は、TBTの環境的に適切な濃度ですでに観察された。これらの結果は、生きている動物における化合物の臓器間のクロストークおよび代謝改変に基づいて、化合物の効果を検出するGRIZLYアッセイの電位を示している。彼らはまた、環境モニタリングのためのGRIZLYアッセイのアプリケーションの可能性を強調。したがって、内分泌かく乱物質の影響はかく乱はデキサメタゾンなどのGRアゴニストにより誘導されたGCシグナル伝達活性を妨害受容体シグナル伝達のレベルで研究することができる。もう一つの可能​​性は、プレグネノロンに刺激されたGC合成に対する化合物の効果を研究することです。ハイスループットアッセイの品質は、環境サンプルライブラリーの迅速なスクリーニングを可能にすべきである。

Arなどのルシフェラーゼの使用eporter遺伝子が活動^{23シグナル}伝達の検出を高ダイナミックレンジを可能にします。実際に、アッセイの感度は、単一の幼虫¹⁸から浸透圧ストレス誘導GC産生を検出することができる。ルシフェラーゼレポーターで達成される高時間分解能は、私たちはまた、データの動態を解析することを可能にした、時間をかけて活動をシグナルに従うことができます。

いくつかのアプリケーションのための潜在的な欠点は、このレポーター系の空間的な監視のための限られた適合性である。蛍光レポーターシステムは、幼虫の特定の領域の監視を必要とアッセイに適している可能性があります。しかしながら、このようなアッセイはまた、蛍光化合物の検出に限界をもたらす励起光によって引き起こされるバックグラウンド効果に起因する低い感度苦しむかもしれない。さらに、それらが原因蛍光タンパク質²³の一般的に高い安定性の少ない速度論的分割を提供することがあります。さらに、それらは、小さな研究室のためのそれらの使用が制限されることがあり、撮像装置、データ分析及びデータ記憶の点で課題を提示する。

マイクロタイタープレートベースのアッセイとしてGRIZLYアッセイのセットアップは、一般的なスクリーニングワークフローに簡単に統合することができます。アッセイは、そのシンプルなハンドリングとデータ分析のために小さいの研究室にも容易に適用可能である。同時に、それは、例えばロボットピペッティングまたはデバイス^24,25をソートすることにより、胚の胚の配分を自動化することにより薬物適用を自動化、自動化の実質的な程度を可能にする。単純な読み出しは自動スクリーニング顕微鏡や高度な画像解析ソフトウェアを必要とし、まだ研究されシグナル伝達経路の時間的および量的な側面に関するデータが豊富に用意されていません。

要約すると、我々は、GCのための比較的安価な頑丈で扱いやすい化学スクリーニングアッセイのためのステップバイステップのプロトコルを提示生体内でリアルタイムでシグナル伝達活性。 GCアッセイは、細胞培養ベースのアッセイでは検出できないシグナル伝達に対する化合物のインビボ効果の決定を可能にする。アッセイのための多くのアプリケーションの中では、グルココルチコイドシグナル、グルココルチコイドの合成およびシグナル伝達活性に対する内分泌かく乱作用の環境モニタリング、およびGCシグナルまたはこれの生体調節物質における新規のために望ましくない影響のための化合物のスクリーニングに遺伝的影響の決定EGです重要なシグナル伝達経路。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Buffer composition + reagents
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Carl Roth GmbH & Co KG	A994.2
FDA approved drug library	Enzo Life Sciences	BML-2841-0100
Luciferin	Biosynth	L-8220
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
E3	N/A	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2
			Instruments
Multiprobe II	PerkinElmer		8 channel, equipped with disposable tip adaptor
Liquidator 96	Steinbrenner Laborsysteme		hand-operated 96-channel pipette
EnVision XCite Multilabel Plate Reader	PerkinElmer		Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector
			Plasticware + consumables
96-Well Storage Plate	ABgene	AB-0765	round well, 0.8 ml
Cover films,	ratiolab	6018412	self adhesive, DMSO resistent
Pipette tips	Steinbrenner Laborsysteme	LRF-200L	for liquidator 96, 200 μl, low retention
TopSeal-A	PerkinElmer	6005185
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005299	white opaque 96-well microplate
Barcode Labels	PerkinElmer	1608182
filtered polypropylene IsoTip pipette tips	Corning	S058.4809
			Animals
GRE:Luc fish	N/A	ZDB-TGCONSTRCT-120920-1	available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe