इन्फ्रारेड तंत्रिका उत्तेजना के तंत्र की जांच के लिए पूरे सेल पैच दबाना
Summary
इन्फ्रारेड तंत्रिका उत्तेजना श्रवण प्रणाली से जुड़े लोगों सहित तंत्रिका प्रकार की एक सीमा में बिजली की उत्तेजना के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है. इस प्रोटोकॉल प्राथमिक श्रवण न्यूरॉन्स की एक संस्कृति में अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना के तंत्र के अध्ययन के लिए एक पैच दबाना विधि का वर्णन करता है.
Abstract
यह स्पंदित, अवरक्त प्रकाश लेजर लक्ष्य ऊतक के किसी भी आगे संशोधन की स्वतंत्र, तंत्रिका ऊतक में बिजली प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि हाल के वर्षों में प्रदर्शित किया गया है. इन्फ्रारेड तंत्रिका उत्तेजना श्रवण तंत्रिका में न्यूरॉन्स की उत्तेजना में दिखाया विशेष रुचि के साथ, vivo में परिधीय और संवेदी तंत्रिका ऊतक की एक किस्म में सूचित किया गया है. आईएनएस इन स्थितियों में काम करने के लिए दिखाया गया है हालांकि, जबकि, अवरक्त प्रकाश तंत्रिका उत्तेजना का कारण बनता है जिसके द्वारा तंत्र (या तंत्र) वर्तमान में अच्छी तरह से नहीं समझा गया है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सुसंस्कृत प्राथमिक श्रवण न्यूरॉन्स में अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना की जांच की सुविधा के लिए बनाया गया एक पूरे सेल पैच दबाना विधि का वर्णन करता है. अच्छी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों में इन विट्रो में अवरक्त लेजर रोशनी के लिए इन कोशिकाओं की प्रतिक्रिया निस्र्पक करके, यह मौलिक physica की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए संभव हो सकता हैएल और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना अंतर्निहित.
Introduction
Neurophysiology और चिकित्सा बायोनिक्स के क्षेत्रों तंत्रिका ऊतक में प्रतिक्रियाओं का विद्युत चलाया उत्तेजना की अनुमति है कि तकनीक पर काफी भरोसा है. बिजली की उत्तेजना तंत्रिका उत्तेजना में स्वर्ण मानक रहता है तंत्रिका प्रतिक्रियाओं, और ऊतक 1 आसपास में वर्तमान के प्रसार के कारण उत्तेजना विशिष्टता की कमी जब रिकॉर्डिंग, यह इस तरह की उत्तेजना कलाकृतियों की उपस्थिति के रूप में कमियों के एक नंबर से ग्रस्त है.
पिछले दो दशकों ऑप्टिकली मध्यस्थता उत्तेजना तकनीक 2 के विकास को देखा है. इन तकनीकों में से कई या तो एक विशेष अणु के अलावा (जैसे बंदी अणुओं) 3 या एक अनुसंधान की स्थापना के बाहर आसानी से लागू कर रहे हैं, जिनमें से न तो आनुवंशिक हेरफेर के कुछ फार्म (जैसे optogenetics) 4, के माध्यम से, लक्ष्य ऊतक के संशोधन की आवश्यकता है. खास रुचि इसलिए अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना (आईएनएस), whereb हैवाई तंत्रिका ऊतक स्पंदित अवरक्त लेजर प्रकाश से उत्साहित है. आईएनएस तंत्रिका ऊतक 2 के अति विशिष्ट, गैर संपर्क उत्तेजना को सक्षम करने से बिजली की उत्तेजना की कमियों के कई उबरने की क्षमता है. आईएनएस सफलतापूर्वक विवो में सेटिंग्स की एक किस्म में प्रदर्शन किया गया है, जबकि हालांकि, उत्तेजना की सटीक व्यवस्था अनिश्चित बनी हुई है.
हाल के कुछ प्रकाशनों 5-7 आईएनएस के पीछे तंत्र को उजागर करने की दिशा में प्रगति हुई है. पानी से लेजर प्रकाश के अवशोषण के कारण तेजी से गर्म एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं प्रकट होता है. हालांकि, इस से परे एक आम सहमति अभी तक पहुँच सकता है. शापिरो एट अल. 7 तेजी हीटिंग कोशिका झिल्ली और बाद विध्रुवण की समाई में एक परिवर्तन के लिए अग्रणी, कोशिका झिल्ली को आसन्न आरोप लगाया कणों के वितरण में गड़बड़ी का कारण बनता है जिससे एक बेहद सामान्य तंत्र का प्रस्ताव. इसके अलावा, अल्बर्ट एट अल. 5 कि लेस जोरआर प्रेरित हीटिंग आयनों कोशिका झिल्ली के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देता है, तापमान संवेदनशील आयन चैनल (क्षणिक रिसेप्टर संभावित vanilloid चैनल) की एक विशेष वर्ग को सक्रिय करता है. इस स्तर पर यह पहचान करने के लिए अभी तक कर रहे हैं कि आगे कारक हैं कि क्या वास्तव में इन तंत्रों गठबंधन कैसे स्पष्ट नहीं है, या.
प्रकाशनों की एक छोटी संख्या (संदर्भ 5,7-9) इन विट्रो में आईएनएस की जांच की है हालांकि, इस क्षेत्र में प्रकाशित काम के विशाल बहुमत (जैसे संदर्भ 1,6,10-18) vivo में बाहर किया गया है. श्रवण न्यूरॉन्स की इन्फ्रारेड उत्तेजना कर्णावत प्रत्यारोपण 10,14-18 में संभावित अनुप्रयोगों के कारण विशेष हित के एक क्षेत्र में किया गया है. विवो प्रयोगों में विभिन्न सेटिंग्स में तकनीक इन विट्रो अध्ययन में afforded द्वारा नियंत्रण की वृद्धि हुई स्तर यांत्रिक के एक अधिक विस्तृत समझ के लिए नेतृत्व की उम्मीद है की प्रभावशीलता को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण हैंआईएनएस के लिए जिम्मेदार anism. इस रिपोर्ट में ये भी श्रवण प्रणाली से मौजूदा डेटा की बड़ी शरीर को जोड़ने जबकि मौलिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में पैच दबाना जांच के लिए सुसंस्कृत सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की तैयारी का वर्णन करता है.
पैच दबाना तकनीक एकल कक्षों में बिजली की गतिविधि की रिकॉर्डिंग का एक साधन उपलब्ध कराने और व्यक्ति अंतर्निहित धाराओं 19 के योगदान का अध्ययन, electrophysiological घटना की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है. इस तकनीक ऐसी सुसंस्कृत सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स के रूप में प्राथमिक न्यूरॉन्स की इन विट्रो तैयारी में एक स्थिर करने के लिए लागू किया जाता है, यह गहराई तंत्रिका गतिविधि नियंत्रित और चालाकी है जिसके द्वारा तंत्र में अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है.
पैच दबाना माध्यम सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की बिजली के गुणों पर लेजर उत्तेजना के प्रभाव की जांच के लिए इस काम की रूपरेखा तरीकों में निर्दिष्ट प्रोटोकॉलरिकॉर्डिंग. दृष्टिकोण मानक खुर्दबीन विन्यास को संशोधित करने की आवश्यकता के बिना सुरक्षित संचालन के साथ ही आसान और अधिक repeatable संरेखण की इजाजत दी, बल्कि एक मुक्त अंतरिक्ष लेजर से एक फाइबर मिलकर लेजर पर आधारित है. इन प्रोटोकॉल के आधार पर, यह और अधिक स्पष्ट रूप से आईएनएस के पीछे तंत्र या तंत्र का निर्धारण करने के क्रम में प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला का संचालन करने के लिए संभव हो जाना चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर इसे निकालने और संस्कृति सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स और पूरे सेल पैच दबाना प्रयोगों प्रदर्शन से लेजर पैदा बिजली की गतिविधि की जांच करने के लिए संभव है. इ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के संबंध परियोजना अनुदान LP120100264 तहत ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
References
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