Summary

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

Published: July 31, 2013
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Summary

La estimulación del nervio infrarrojos ha sido propuesta como una alternativa a la estimulación eléctrica en una gama de tipos de nervios, incluyendo los asociados con el sistema auditivo. Este protocolo describe un método de patch clamp para estudiar el mecanismo de estimulación nerviosa de infrarrojos en un cultivo de neuronas auditivas primarias.

Abstract

Se ha demostrado en los últimos años que la luz láser pulsado, infrarrojos puede ser utilizado para provocar respuestas eléctricas en el tejido neural, independiente de cualquier modificación adicional del tejido diana. Estimulación neural de infrarrojos ha sido reportado en una variedad de tejido neural periférica y sensorial in vivo, con particular interés se muestra en la estimulación de las neuronas en el nervio auditivo. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado que funciona en esta configuración, el mecanismo (o mecanismos) por el cual la luz infrarroja provoca excitación neuronal está actualmente no se entiende bien. El protocolo presentado aquí describe un método de patch clamp de célula completa diseñada para facilitar la investigación de la estimulación neural de infrarrojos en las neuronas auditivas primarias cultivadas. Al caracterizar a fondo la respuesta de estas células a la iluminación láser infrarrojo in vitro bajo condiciones controladas, puede ser posible obtener una mejor comprensión de la Physica fundamentall y procesos bioquímicos subyacentes estimulación neural infrarrojos.

Introduction

Los campos de la neurofisiología y médica biónica dependen en gran medida en las técnicas que permiten la estimulación controlable de respuestas eléctricas en el tejido neural. Mientras que la estimulación eléctrica sigue siendo el estándar de oro en la excitación neuronal, que adolece de una serie de inconvenientes tales como la presencia de artefactos de estimulación cuando se graban las respuestas neurales, y la falta de especificidad de la estimulación debido a la propagación de la corriente en el tejido circundante 1.

Las últimas dos décadas han visto el desarrollo de técnicas de estimulación mediada ópticamente 2. Varias de estas técnicas requieren la modificación del tejido diana, ya sea a través de la adición de una molécula en particular (por ejemplo, moléculas de jaula) 3 o alguna forma de manipulación genética (por ejemplo, la optogenética) 4, ninguno de los cuales son fáciles de aplicar fuera de un contexto de investigación. De particular interés, por tanto, la estimulación neural infrarrojos (INS), whereby tejido nervioso se excita con luz láser infrarroja pulsada. INS tiene el potencial de superar muchas de las deficiencias de la estimulación eléctrica, permitiendo altamente específica, la estimulación sin contacto de tejido neural 2. Sin embargo, mientras que el INS se ha demostrado con éxito en una variedad de ajustes in vivo, el mecanismo preciso de la excitación sigue siendo incierto.

Algunas publicaciones recientes han mostrado un progreso hacia el descubrimiento del mecanismo detrás de INS 5-7. Calentamiento rápido debido a la absorción de la luz láser por el agua parece jugar un papel clave. Sin embargo, más allá de este consenso aún no se ha alcanzado. Shapiro et al. 7 proponen un mecanismo muy general según el cual el calentamiento rápido hace que una perturbación en la distribución de partículas cargadas adyacentes a la membrana celular, que conduce a un cambio en la capacitancia de la membrana celular y la posterior despolarización. Además, Albert et al. 5 afirman que lasecalefacción inducida r activa una clase específica de temperatura canales iónicos sensibles (receptor de potencial transitorio canales vaniloide), permitiendo que los iones pasen a través de la membrana celular. En esta etapa no está claro cómo se combinan estos mecanismos, o incluso si hay otros factores que aún no se han identificado.

Aunque un pequeño número de publicaciones (referencias 5,7-9) han investigado INS in vitro, la gran mayoría de los trabajos publicados en este campo se ha llevado a cabo in vivo (por ejemplo, referencias 1,6,10-18). Estimulación de las neuronas auditivas infrarrojos ha sido un área de particular interés, debido a las potenciales aplicaciones en implantes cocleares 10,14-18. Mientras que en experimentos in vivo son importantes para verificar la eficacia de la técnica en diversos entornos, el aumento del nivel de control proporcionado por los estudios in vitro se espera que conduzca a una comprensión más detallada del mecanismonismo responsable de INS. Este informe describe la preparación de cultivos de neuronas del ganglio espiral para las investigaciones de patch clamp, ya que estos pueden ser utilizados para estudiar los mecanismos fundamentales mientras que también une a la gran cantidad de datos existentes en el sistema auditivo.

La técnica de patch clamp es una excelente herramienta para la investigación de los fenómenos electrofisiológicos, proporcionando un medio de registro de la actividad eléctrica en las células individuales y el estudio de la contribución de las corrientes subyacentes individuales 19. Cuando esta técnica se aplica a un establo en la preparación in vitro de neuronas primarias, como las neuronas del ganglio espiral cultivadas, ofrece la oportunidad de estudiar en profundidad los mecanismos por los que la actividad neuronal es controlada y manipulada.

Los protocolos especificados en este trabajo se resumen los métodos para investigar el efecto de la estimulación con láser en las propiedades eléctricas de las neuronas del ganglio espiral a través de patch clampgrabaciones. El enfoque se basa en un láser de fibra de acoplamiento en lugar de un láser en el espacio libre, que permite un funcionamiento más seguro, así como más fácil y más repetible alineación sin la necesidad de modificar la configuración de microscopio estándar. Sobre la base de estos protocolos, debería ser posible llevar a cabo una amplia gama de experimentos con el fin de determinar más claramente el mecanismo o los mecanismos detrás de INS.

Protocol

1. Cultura de las neuronas del ganglio espiral Esterilizar pequeñas y redondas (por ejemplo, 10 mm de diámetro) cubreobjetos de vidrio y pinzas curvas en un autoclave. Transfiera los portaobjetos esterilizados en pocillos individuales de una 4-anillo de 35 mm placa de Petri estéril o placa de 4 pocillos, utilizando las pinzas esterilizadas. Aplicar 150 l de poli-L-ornitina (500 mg / ml) y laminina de ratón (0,01 mg / ml) a la superficie superior del cubreobjetos y colocar en una incubadora (37 °…

Representative Results

Las neuronas del ganglio espiral responden a la iluminación con láser de formas de onda en tanto repetible de fijación de voltaje y configuraciones de grabación actual-clamp. Figura 3a muestra los cambios típicos en el flujo de corriente a través de una membrana celular en respuesta a un 2,5 mseg, 0,8 mJ láser de pulso (respuesta promedio de 6 pulsos de láser, que se repite en intervalos de 1 seg) con el potencial de membrana se celebró en -70 mV, -60 mV y -50 mV. Corrientes de entrada netos se…

Discussion

Usando los protocolos descritos en este documento, es posible extraer y cultura neuronas del ganglio espiral y para investigar laser-evocó actividad eléctrica mediante la realización de experimentos de patch clamp de células enteras. Cuando se usa in vitro, la técnica de patch clamp proporciona un nivel de control sobre los parámetros experimentales que no es alcanzable in vivo. Parámetros de estimulación láser, tales como longitud de onda, energía de pulso, duración del pulso, forma del pul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por el Consejo Australiano de Investigación bajo Vinculación del proyecto de subvención LP120100264.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

References

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Cite This Article
Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

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