Préparation de la recombinaison de protéines Mgm101 par la stratégie de marquage MBP basée
Summary
La protéine de nucléoïde mitochondrial de la levure, Mgm101, est une protéine de recombinaison Rad52 type qui forme des gros anneaux oligomères. Un protocole est décrit pour préparer Mgm101 recombinant soluble avec la protéine de liaison du maltose (MBP)-tagging stratégie couplée avec échange de cations et la chromatographie d'exclusion stérique.
Abstract
Le gène a été identifié MGM101 il ya 20 ans pour son rôle dans le maintien de l'ADN mitochondrial. Études réalisées dans plusieurs groupes ont suggéré que la protéine Mgm101 est impliqué dans la réparation par recombinaison de l'ADN mitochondrial. Des études récentes ont indiqué que Mgm101 est lié à la famille des protéines de recombinaison Rad52 type. Ces protéines forment des anneaux oligomères et de promouvoir l'hybridation de molécules d'ADN simple brin homologue simples. Cependant, la caractérisation des Mgm101 a été entravée par la difficulté à produire la protéine recombinante. Ici, une procédure fiable pour la préparation recombinante de Mgm101 est décrite. Protéine liant le maltose (MBP) étiquetée Mgm101 est d'abord exprimé dans Escherichia coli. La protéine de fusion est d'abord purifié par chromatographie d'affinité en amylose. Après avoir été libéré par clivage protéolytique, Mgm101 est séparée de MBP par chromatographie d'échange cationique. Monodispersé Mgm101 est alors obtenuepar chromatographie d'exclusion de taille. Un rendement de ~ 0,87 mg de Mgm101 par litre de culture bactérienne peut être obtenue régulièrement. Le Mgm101 recombinante a un minimum de contamination de l'ADN. Les échantillons préparés sont utilisés avec succès pour biochimiques, structurelles et unique analyse d'images de particules de Mgm101. Ce protocole peut aussi être utilisé pour la préparation d'autres grandes protéines liant l'ADN oligomères qui peuvent être mal repliées et toxique pour les cellules bactériennes.
Introduction
La recombinaison homologue est important pour la réparation des cassures double-brin (CDB) et interbrins réticule, et pour la reprise de la réplication de l'ADN à partir des fourches de réplication effondrées 1. En recombinaison homologue conventionnelle, la réaction central est catalysée par les recombinases ATP-dépendants dont RecA chez les procaryotes et Rad51 et Dmc1 chez les eucaryotes 1-3. Ces recombinases former des filaments nucléoprotéiques sur ssDNA, qui sont essentiels pour initier recherche d'homologie et l'invasion de brin au sein de matrices d'ADN duplex (figure 1, cadre de gauche) 4-7. En plus du schéma classique, la recombinaison homologue peut également avoir lieu d'une manière RecA/Rad51-independent (figure 1, cadre de droite). Par exemple, la levure RAD52 et Rad59 protéines peuvent directement catalyser le recuit de brins d'ADN simple brin complémentaires qui sont exposées par la résection des pauses ADN double brin. Ce processus de recombinaison, connu sous le nom chanterLe fil recuit, généralement n'implique pas appariement homologue des modèles ADN double brin. Après recuit, les queues hétérologues sont éliminés par des exonucléases et pseudos sont ligués pour restaurer 8-10 continuité du génome. Réparation par le mécanisme de recuit simple brin est souvent accompagnée de suppressions de séquences génomiques entre les régions directement répétées.
Rad52 appartient à un groupe diversifié de protéines de recombinaison qui sont répandues parmi les bactériophages 11. Ces protéines sont également connus comme simples protéines recuit Strand (SSAP), en fonction de leur activité dans la promotion de l'hybridation de molécules d'ADN simple brin homologue simples. Les meilleurs SSAP de bactériophages sont caractérisés Redβ et Erf du bactériophages λ et P22, RecT du prophage rac et la protéine Sak du phage lactococcal UL36. Les SSAP sont structurellement caractérisées par un pli β-β-β-α typique, bien similitude est pratiquement indétectablepouvoir dans leurs séquences primaires. Tous ces pays sont de grands anneaux homo-oligomères de 10-14 symétrie in vitro 12-14. Les conséquences fonctionnelles de cet ordre organisation structurelle plus caractéristique n'est pas bien comprise.
Nous sommes intéressés à comprendre le mécanisme de recombinaison homologue dans le génome mitochondrial. Nous avons déjà identifié le gène MGM101 qui est essentielle pour le maintien de l'ADNmt dans Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 a ensuite été trouvée associée avec nucléoïdes mitochondriales et est nécessaire pour la tolérance de l'ADNmt à des agents endommageant l'ADN 16. Cependant, l'étude de Mgm101 a été retenu dans la dernière décennie par la difficulté de produire Mgm101 recombinant. Nous avons récemment réussi à produire Mgm101 soluble à de grandes quantités de E. coli en utilisant la stratégie de fusion MBP. Cela nous a permis de démontrer que Mgm101 actionssimilitudes biochimiques et structurales avec la Rad52-famille de protéines 17,18. Dans ce rapport, une procédure de purification en trois étapes est décrite, qui produit Mgm101for analyses biochimiques et structurales homogènes (figure 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il a été un défi pour produire une protéine stable, native recombinante Mgm101 de E. coli peut-être en raison de son insolubilité dans les cellules bactériennes. Dans ce rapport, nous montrons que la stratégie MBP-fusion permet à la protéine d'être exprimée à un niveau raisonnablement élevé. En utilisant une coloration microscopie électronique à transmission négative et la chromatographie d'exclusion stérique, nous avons précédemment montré que la protéine MBP-fusion forme des oli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Wilkens Stephan à l'aide de la microscopie électronique à transmission. Ce travail a été financé par les Instituts de Grant Santé R01AG023731 nationale.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
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