Beredning av Mgm101 rekombinationsprotein av MBP-baserade taggning strategi
Summary
Den jästmitokondriella nucleoid protein, Mgm101, är en Rad52-typ rekombinationsprotein som bildar stora oligomera ringar. Ett protokoll beskrivs för framställning av lösligt rekombinant Mgm101 med maltosbindande protein (MBP)-taggning strategi tillsammans med katjonbyte och storleksuteslutningskromatografi.
Abstract
Den MGM101 genen identifierades 20 år sedan för sin roll i upprätthållandet av mitokondrie-DNA. Studier från flera grupper har föreslagit att Mgm101 protein är involverat i den rekombinatoriska reparation av mitokondrie-DNA. Nyligen utförda undersökningar har visat att Mgm101 är relaterad till Rad52-typ rekombinationsprotein familj. Dessa proteiner bildar stora oligomera ringar och främja hybridisering av homologa enkelsträngade DNA-molekyler. Emellertid har karakteriseringen av Mgm101 har hindrats av svårigheten att framställa det rekombinanta proteinet. Här används en tillförlitlig procedur för framställning av rekombinant Mgm101 beskrivas. Maltosbindningsprotein (MBP)-märkta är Mgm101 först uttrycks i Escherichia coli. Fusionsproteinet är initialt renas genom amylos affinitetskromatografi. Efter att ha släppts genom proteolytisk klyvning, är Mgm101 separeras från MBP genom katjonbyteskromatografi. Monodispergerade Mgm101 erhålls däreftergenom storleksuteslutningskromatografi. Ett utbyte av ungefär 0,87 mg Mgm101 per liter bakteriekultur kan rutinmässigt erhållas. Den rekombinanta Mgm101 har minimal kontaminering av DNA. De preparerade proverna används framgångsrikt för biokemiska, strukturella och enstaka analyser partikel bild av Mgm101. Detta protokoll kan också användas för framställning av andra stora oligomera DNA-bindande proteiner som kan misfolded och giftigt för bakterieceller.
Introduction
Homolog rekombination är viktigt för reparation av dubbel-strängbrott (DSB) och intersträng antipyridinantikropp, och för återinsättande av DNA-replikation från kollapsade replikationsgafflar 1. Vid konventionell homolog rekombination, förstörs den centrala reaktion som katalyseras av de ATP-beroende rekombinaser inklusive RecA i prokaryoter, och Rad51 och Dmc1 i eukaryoter 1-3. Dessa rekombinaser bildar nukleoproteinkomplex filament på ssDNA, vilka är nödvändiga för att initiera homologisökning och sträng invasion i duplex-DNA-mallar (Figur 1, vänstra panelen) 4-7. Förutom det konventionella systemet, kan homolog rekombination äger också rum i en RecA/Rad51-independent sätt (figur 1, högra panelen). Exempelvis kan jästen Rad52 och Rad59 proteinerna katalyserar direkt annealing av komplementära ssDNA-strängar som är exponerade genom resectioning av dsDNA-raster. Denna rekombination process, känd som sjungerle sträng glödgning, i allmänhet inte involverar homolog parning med dsDNA mallar. Efter glödgning, är heterologa svansar bort genom exonukleaser och skråmor ligeras att återställa 8-10 genomet kontinuitet. Reparation av enkelsträngen glödgning mekanism åtföljs ofta av deletioner av genomiska sekvenser mellan direkt upprepade regioner.
Rad52 tillhör olika grupper av rekombinationsproteiner som är utbredd bland bakteriofager 11. Dessa proteiner är också kända som enkelsträng Glödgning Protein (SSAPs), baserat på deras aktivitet för att främja hybridisering av homologa enkelsträngade DNA-molekyler. De bäst karakteriserade bakteriofager SSAPs är Redp och Erf från bakteriofager λ och P22, RecT från profagen rac och Sak proteinet från Lactococcus fag UL36. De SSAPs är strukturellt kännetecknas av en typisk β-β-β-α faldigt, även om likheten är så gott undetectstånd i deras primära sekvenser. De alla utgör stora homo-oligomera ringar på 10 – 14-faldig symmetri in vitro 12-14. De funktionella implikationerna av denna egenskap högre ordning organisationsstruktur är inte klarlagd.
Vi är intresserade av att förstå mekanismen av homolog rekombination i mitokondriella genomet. Vi har tidigare identifierat den MGM101 gen som är nödvändig för upprätthållandet av mtDNA i Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 därefter befanns vara associerad med mitokondriella nucleoids och krävs för toleransen av mtDNA till DNA-skadande ämnen 16. Dock har studier av Mgm101 hållits tillbaka under det senaste decenniet av svårigheten att producera rekombinant Mgm101. Vi har nyligen lyckats framställa lösligt Mgm101 vid stora kvantiteter från E. coli använder MBP-fusion strategi. Detta har gjort det möjligt för oss att visa att Mgm101 aktierbiokemiska och strukturella likheter med Rad52-familjen av proteiner 17,18. I denna rapport, är ett tre-steg rening som beskrivs, som producerar homogena Mgm101for biokemiska och strukturella analyser (Figur 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har varit en utmaning att skapa en stabil, infödd rekombinant Mgm101 protein från E. coli möjligen på grund av sin olöslighet i bakterieceller. I denna rapport visar vi att MBP-fusion strategi gör att proteinet ska uttryckas på en rimligt hög nivå. Genom att använda negativ färgning transmissionselektronmikroskop och storleksuteslutande kromatografi har vi visat tidigare att MBP-fusionsproteinet bildar enhetliga oligomerer in vitro 18. Det är möjligt att vikningen och oligom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Stephan Wilkens för hjälp i transmissionselektronmikroskopi. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01AG023731.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Expression vector pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission Protease | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAse I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column chromatography column | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade column | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS0611 |
References
- San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
- Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
- Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
- Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
- Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
- Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
- Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
- Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
- Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
- Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
- Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
- Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
- Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
- Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
- Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
- Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
- Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
- Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
- Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
- Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
- Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).
