Metoder for å lage humane 3D tumorvev som testsystemer er beskrevet. Disse teknologier er basert på et biologisk decellularized vaskularisert Stillas (BioVaSc), primære humane celler, og en tumorcellelinje som kan dyrkes i henhold til statiske så vel som under dynamiske forhold i en strømnings bioreaktor.
Kreft er en av de ledende dødsårsakene i verden. Nåværende terapeutiske strategier er hovedsakelig utviklet i 2D kultur-systemer, som er mangelfullt gjenspeiler fysiologiske forhold i vivo. Biologiske 3D matriser gir celler et miljø der celler kan selv-ordne, slik at undersøkelse av vev organisasjon og celledifferensiering. Slike stillasene kan bli seedet med en blanding av ulike celletyper å studere direkte 3D-celle-celle-interaksjoner. Å etterligne 3D kompleksiteten av kreftsvulster, har vår gruppe utviklet en 3D in vitro svulst testsystem.
Våre 3D vevsprøve systemmodeller in vivo situasjonen for ondartet perifere nerve slire svulster (MPNSTs), som vi etablerte med vår decellularized svin jejunal segment avledet biologisk vaskularisert stillas (BioVaSc). I vår modell, reseeded vi en modifisert BioVaSc matrise med primære fibroblaster, mikrovaskulære endotelceller (mvECs) og S462 tumor-cellelinjen. For statisk kultur, er den vaskulære strukturen av BioVaSc fjernet og den gjenværende stillaset skjæres åpent på den ene side (Small Intestinal submucosa SIS-MUC). Den resulterende matriks blir deretter fast mellom to metallringer (celle kroner).
Et annet alternativ er å kultur cellen-seeded SIS-Muc i en flyt bioreaktor system som eksponerer cellene til å skjære stress. Her blir bioreaktor koblet til en peristaltisk pumpe i et selv konstruert inkubator. En datamaskin regulerer arterielle oksygen og næringstilførsel via parametre slik som blodtrykket, temperatur og strømningshastighet. Dette oppsettet gir en dynamisk kultur med enten trykkregulerte pulsatile eller konstant flyt.
I denne studien, kunne vi med hell etablere både en statisk og dynamisk 3D kultur system for MPNSTs. Evnen til å modellere kreftsvulster i en mer naturlig 3D-miljø vil gjøre oppdagelsen, testing, og validering avfremtidige legemidler i en menneskelignende modell.
Nye legemidler må godkjennes i forhold til kvalitet, sikkerhet og effekt før markedsgodkjennelse. Til dags dato, dyreforsøk er standard metode for narkotika testing og validering. Men på grunn av artsspesifikke forskjeller, dyreforsøk ofte ikke omfattende evaluere effekten av forbindelsene hos mennesker 1. Av denne grunn er det viktig å generere humane vev modeller som kan brukes for in vitro-tester av nye stoffer og stoffer.
En av de fokuserer på vår gruppe er etableringen av in vitro testmodeller med vår biologiske vaskularisert stillas (BioVaSc) 2,3. Den BioVaSc kan brukes som en statisk eller dynamisk 3D matrisesystem. For statisk kultur, er det decellularized svin jejunal segmentet (Small Intestinal submukosa SIS-Muc) plassert i en metallinnlegg for celle reseeding. Forskjellige celler, slik som kreft og endoteliale celler kan dyrkes på stillaset.
<pclass = "jove_content"> For dynamisk kultur, er BioVaSc festet til en bioreaktor-systemet som gjelder flyte gjennom vaskulaturen eller over overflaten av stillaset. Omløps bioreaktorer implementere biologiske, mekaniske eller elektriske stimuli som fungerer på differensiering eller spredning av celler fire. For bioreaktorer innen Tissue Engineering, er det grunnleggende konseptet for å simulere forholdene i menneskekroppen. Hvori, er celler gitt et naturlig miljø der de kan samhandle med hverandre og deres omkringliggende ekstracellulære matrise. For fremstilling av in vitro-testsystemer eller transplantasjoner, er evnen til å etterligne det naturlige miljøet i cellene med en passende bærerstruktur og bioreactor system kritisk 5. Derfor må mer komplekse og teknisk krevende enheter være utviklet for å oppfylle disse oppgavene seks.Det er videre mulig å bruke vår stillaset for etablishment av en vaskularisert modell på grunn av de bevarte rørformede strukturer, som omfatter foring arterie, vene, og forbindelses kapillær sengen. Alle svin celler må fjernes ved kjemisk, mekanisk og enzymatisk decellularization, og stillaset gamma-sterilisert. De gjenopprettede rørformede vaskulære strukturer kan deretter sådd på nytt med humane mikrovaskulære endotelceller ved hjelp av en resirkulerings-perfusjon bioreaktor 7, som etterligner de biomekaniske og / eller biokjemiske parametre som pH, temperatur, trykk, næringstilførsel og avfallsfjerning 6.. Den re-endothelialization av de rørformede strukturer skaper en menneskelig blodkar ekvivalent innenfor den kollagene stillaset 3,7. I det neste trinnet, kan overflaten av det tidligere lumen (mucosa) bli sådd med primære humane celler for å etablere ko-kulturer 3,7,8.
I denne studien en 3D svulst testsystem er satt opp av co-dyrkning en tumor cellelinje med primær stRomal cellene under statiske og dynamiske forhold på SIS-Muc.
Når man sammenligner 2D-og 3D-kultur-systemer i tumor forskning, 3D-systemer, til tross for at den dyrere tilnærming, har vist seg å etterligne forholdene i biologiske microenvironments bedre. Det kan bli vist at noen tumorceller vokse langt langsommere i en 3D-kultur enn i en vanlig 2D kultur 12, som er i henhold til situasjonen i et fast tumor. Bissell og kolleger viste i sitt arbeid at atferden til kreftfremkallende brystcellene reflekterer in vivo situasjon, inkludert celle morfologi og signalering, mer nøyaktig når et 3D-kultur i en matrise tilbyr celle-ECM interaksjoner. Videre er understreket de viktigheten av det ekstracellulære miljø i 3D ved å demonstrere at endringer i miljøvern interaksjoner førte til tilbakeføring av de ondartede cellene til en normal fenotype. I tillegg, og viktigst, kan disse resultatene også bli bekreftet i in vivo dyremodeller 10,11.
ontent "> Den direkte sammenligning av in vivo-dyreforsøk og in vitro vev modeller viser fordeler og ulemper i begge systemer. Én fordel av in vitro-modeller er tillatelse av en mye bedre i sanntid eller fast avbildning ved mikroskopi. En begrensning er at de etterligner statisk eller kortsiktige forhold, mens in vivo-systemer ofte fremgang. Den nåværende mangelen på blodkar og normal transport av små molekyler, vert immunreaksjoner, og andre celle-celle interaksjoner er flere ulemper ved in vitro-modeller 12. Derfor 3D in vitro-systemer som presenteres i denne studien har en lovende tillegg til dyreforsøk. De gir et bedre sammenlignbarhet for den menneskelige organisme, og dermed minimere eksperimentelle feiltolkninger. Biomimetic in vivo modellsystemer vil derfor bli mer relevant å studere hvordan kreft og metastatisk spredningen er avhengig på microenviron forhold som regulerer tumorigenesis 11.Vårt studium viser at den 3D miljø tilbys av SIS-MUC fører til en mer tumor-lignende vev dannelse av celler, som ikke er observert i den felles 2D cellekultur (se figur 3A). Videre er bruken av primære celler avledet fra tumor biopsier et svært viktig skritt i retning av personlig medisin, en disiplin som tar sikte på å identifisere den beste behandling avhengig av pasientens individuelle behov. Innlemming primære pasient-spesifikke tumorceller isolert fra biopsimateriale vil tillate in vitro testing av terapeutiske strategier. Slike testsystemer vil gjøre det mulig å undersøke forskjellige medikamenter og kombinasjoner derav, i en tid-og kostnadssparende high-throughput screening. I tillegg, er integrering av tumorassosierte stromale celler, som vist i denne studien viktig for personlig tilnærming, siden en tumor er mikromiljøet påvirker tumorprogresjon 13, og kan vise seg som suitable terapeutisk mål.
Alternativt til en personlig tilnærming kan vår tumormodell bli endret for å tjene som en generalisert tumortest-system ved inkorporering av etablerte tumorigene cellelinjer. Dette er en lovende tilpasning for grunnleggende forskningsformål. For begge medikamenttesting nærmer nærvær av en vaskulær struktur er nødvendig for å teste fordeling og opptak av terapeutiske stoffer. SIS-Muc matrise lar basolateral seeding med primær mvEC for barriere opptak studier, vil reseeding av de bevarte vaskulære strukturer av BioVaSc ytterligere forbedre studiet av levering av legemidler.
For å skape vev modeller, kan en 3D bionedbrytbar matrise brukes som rammeverk for en ko-kultur i forskjellige celletyper 14. Bruken av slike 3D matrikser er ofte begrenset ved fravær av et funksjonelt vaskularisering. Dette problemet kan løses ved bruk av BioVaSc, som har bevart blodkar structures, som kan reseeded med endotelceller. Videre gir BioVaSc ekstracellulære komponenter, som sikrer vedheft av cellene og legge til rette vev differensiering. Det gjør det også på lang tid vev spesifikk funksjon av kunstig biologisk 3D vev 7,8,15. Forutsetningen for prosjektering av funksjonelle vaskulære substitutter er hermet av menneskets fysiologiske og biomekaniske forhold. Derfor bioreaktorsystemer, som kan implementere disse kravene in vitro, er av ekstrem interesse for å lage biologiske tumor modeller.
Kombinasjonen av BioVaSc, i bioreaktoren teknologi og ko-dyrking av ulike celletyper en svært lovende metode for å generere vascularized tumorvev, noe som vil gjøre det mulig å studere mekanismene er relevante for progresjon av kreft slik som angiogenese og metastase. Vi ser slike tumormodeller som en lovende tilnærming for kompletterer dyrestudier ved å gi en tilsvarendetil den menneskelige tumor fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) for sin tekniske støtte til å utvikle bioreaktorer og bioreaktoren kuvøse.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
FCS | LONZA | DE14-801F | |
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
peristaltic pump | Ismatec | ||
sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
Versene | Gibco | 15040-033 |