وصفت وسائل لخلق أنسجة الورم 3D الإنسان كما نظم الاختبار. وتستند هذه التقنيات على decellularized البيولوجية أوعية دموية سقالة (BioVaSc)، وخلايا الإنسان الأولية وخط الخلية السرطانية، والتي يمكن تربيتها في إطار ثابت وكذلك في ظل ظروف دينامية في مفاعل حيوي التدفق.
السرطان هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. يتم تطوير الاستراتيجيات العلاجية الحالية في الغالب في أنظمة الثقافة 2D، التي تعكس بشكل كاف الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي. المصفوفات 3D البيولوجية توفير بيئة الخلايا في الخلايا التي يمكن تنظيم الذاتي، والسماح للدراسة المنظمة الأنسجة وتمايز الخلايا. يمكن المصنف مثل السقالات مع خليط من أنواع مختلفة من الخلايا لدراسة المباشر 3D خلية خلية التفاعلات. لتقليد تعقيد 3D من الأورام السرطانية، وقد وضعت مجموعتنا في المختبر الورم نظام اختبار 3D.
لدينا نماذج نظام اختبار الأنسجة 3D الوضع في الجسم الحي من الأورام الخبيثة الطرفية العصبية غمد (MPNSTs)، التي وضعناها مع شركائنا decellularized الجزء صائمية الخنازير المستمدة سقالة أوعية دموية البيولوجية (BioVaSc). في نموذجنا، ونحن reseeded على BioVaSc مصفوفة تعديل مع الخلايا الليفية الأولية، الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (mvECs) والورم خط الخلية S462. للثقافة ثابت، تتم إزالة بنية الأوعية الدموية في BioVaSc ويتم قطع السقالة المتبقية مفتوحة على جانب واحد (تحت المخاطية المعوية الصغيرة SIS-MUC). ثم يتم إصلاح المصفوفة الناتجة بين اثنين من حلقات معدنية (التيجان الخلية).
خيار آخر هو ثقافة خلايا المصنف SIS-MUC في نظام مفاعل حيوي تدفق الذي يعرض الخلايا لإجهاد القص. هنا، يتم توصيل مفاعل حيوي لمضخة تحوي في حاضنة المكونة داخليا. كمبيوتر ينظم الأوكسجين الشرياني وتوريد المواد الغذائية عن طريق المعلمات مثل ضغط الدم ودرجة الحرارة ومعدل التدفق. هذا الإعداد يسمح لثقافة ديناميكية مع أي ضغط أو ينظم نابض تدفق مستمر.
في هذه الدراسة، فإننا لا يمكن إنشاء بنجاح كل من نظام الثقافة 3D والدينامية للMPNSTs. والقدرة على تصميم نموذج الأورام السرطانية في بيئة 3D أكثر طبيعية تمكين اكتشاف واختبار والتحقق من صحةالأدوية المستقبل في نموذج مثل الإنسان.
يجب التحقق من صحة الأدوية الجديدة فيما يتعلق جودتها، والسلامة، والكفاءة قبل الترخيص السوق. حتى الآن، التجارب على الحيوانات هي الطريقة القياسية لاختبار المخدرات والتحقق من الصحة. ومع ذلك، بسبب وجود خلافات أنواع محددة، التجارب على الحيوانات في كثير من الأحيان لا تقييم شامل لتأثير المركبات في البشر 1. لهذا السبب، من المهم لتوليد نماذج الأنسجة البشرية التي يمكن استخدامها لفي المختبر اختبارات العقاقير والمواد الجديدة.
واحدة من يركز مجموعتنا هو خلق في المختبر نماذج الاختبار مع سقالة بيولوجية لدينا أوعية دموية (BioVaSc) 2،3. وBioVaSc يمكن استخدامها كنظام مصفوفة 3D ساكنا أو متحركا. للثقافة ثابتة، يتم وضع الجزء decellularized صائمية الخنازير (المعوية الصغيرة تحت المخاطية SIS-MUC) في إدراج المعدن لإعادة زرع النبتة الخلية. خلايا مختلفة، مثل السرطان والخلايا البطانية يمكن تربيتها على منصة الاعدام.
<pالطبقة = "jove_content"> للثقافة ديناميكية، يتم إرفاق BioVaSc إلى نظام مفاعل حيوي التي تنطبق عليها تدفق الأوعية الدموية في جميع أنحاء أو عبر السطح من السقالة. المفاعلات الحيوية الحالية تنفيذ المحفزات البيولوجية والميكانيكية، أو الكهربائية التي تعمل على التفريق أو انتشار الخلايا 4. لالمفاعلات الحيوية في مجال هندسة الأنسجة، والمفهوم الأساسي هو محاكاة الظروف في جسم الإنسان. حيث يتم توفير خلايا البيئة الطبيعية التي يمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض ومصفوفة المحيطة بهم خارج الخلية. لإنتاج أنظمة اختبار في المختبر أو زرع، والقدرة على محاكاة البيئة الطبيعية للخلايا مع بنية الناقل مناسبة ونظام مفاعل حيوي أمر بالغ الأهمية 5. لذلك، يجب وضع أجهزة أكثر تعقيدا وتطلبا من الناحية الفنية من أجل تحقيق هذه المهام 6.وعلاوة على ذلك فمن الممكن استخدام السقالة لدينا أنشأناishment نموذج أوعية دموية بسبب الهياكل الأنبوبية الحفاظ عليها، والتي تشمل الشريان التغذية، الوريد، والسرير الشعرية الموصل. تحتاج جميع خلايا الخنازير إلى إزالتها عن طريق decellularization الكيميائية والميكانيكية والأنزيمية، والسقالة تعقيم غاما. يمكن لاحقا أن reseeded الهياكل الأوعية الدموية أنبوبي استعادتها مع الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان باستخدام مفاعل حيوي إعادة تدوير نضح 7، الذي يحاكي المعلمات النشاط الحيوي و / أو البيوكيميائية مثل الرقم الهيدروجيني، ودرجة الحرارة، والضغط، توريد المواد الغذائية وإزالة النفايات 6. إعادة تبطنن للهياكل أنبوبية يخلق ما يعادل الأوعية الدموية البشرية داخل السقالة 3،7 كولاجيني. في الخطوة التالية، سطح التجويف السابق (الغشاء المخاطي) يمكن المصنف مع الخلايا البشرية الأولية لإنشاء المشترك الثقافات 3،7،8.
في هذه الدراسة تم تعيين نظام اختبار الورم 3D بنسبة شارك في زرع خط خلية الورم مع شارع الرئيسيخلايا romal في ظل ظروف والدينامية على SIS-MUC.
عند المقارنة بين أنظمة الثقافة 2D و 3D في مجال البحوث السرطانية، ونظم 3D، على الرغم من كونها نهج أكثر تكلفة، وقد ثبت لمحاكاة الظروف في microenvironments البيولوجية أفضل. ويمكن أن يتبين أن بعض الخلايا السرطانية تنمو أبطأ بكثير في ثقافة 3D مما كان عليه في ثقافة مشتركة 2D 12، والذي هو وفقا للحالة في الورم الحقيقي. أظهرت بيسيل وزملاء العمل في عملهم أن سلوك خلايا الثدي المسرطنة في الجسم الحي يعكس الوضع، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا والإشارات، أكثر دقة عندما ثقافة 3D داخل مصفوفة يقدم التفاعلات خلية ECM. وعلاوة على ذلك، فإنها شددت على أهمية البيئة خارج الخلية في 3D من خلال إظهار أن التغييرات في التفاعلات البيئية أدت إلى الارتداد من الخلايا الخبيثة إلى النمط الظاهري العادي. بالإضافة إلى ذلك، والأهم من ذلك، ويمكن أيضا أن يتم تأكيد هذه النتائج في النماذج الحيوانية في الجسم الحي 10،11.
ontent "> المقارنة المباشرة لفي الجسم الحي التجارب على الحيوانات ونماذج الأنسجة في المختبر يكشف مزايا وعيوب في كلا النظامين. ميزة واحدة من نماذج في المختبر هو إذن من أفضل بكثير في الوقت الحقيقي أو التصوير الثابت بواسطة المجهر. وجود قيود هو أن أنها تحاكي ظروف ثابتة أو قصيرة الأجل، في حين نظم في الجسم الحي في كثير من الأحيان التقدم. إن النقص الحالي في الأوعية الدموية والنقل العادية من جزيئات صغيرة، استضافة الاستجابات المناعية، وغيرها من التفاعلات خلية خلية هي مزيد من عيوب في المختبر نماذج 12. لذلك، 3D في أنظمة المختبر كما وردت في هذه الدراسة تقدم إضافة واعدة إلى التجارب على الحيوانات. أنها توفر المقارنة أفضل للكائن البشري، وبالتالي تقليل تفسيرات التجريبية. المحاكاة البيولوجية في الجسم الحي ونظم نموذج بالتالي تصبح أكثر ذات الصلة لدراسة كيفية انتشار السرطان النقيلي وتعتمد على الشروط التي تنظم microenvironmental tumorigenesis 11.دراستنا تبين أن البيئة 3D التي تقدمها SIS-MUC يؤدي إلى تشكيل أكثر مثل ورم الأنسجة من الخلايا، التي لم تراع في خلية ثقافة 2D المشتركة (انظر الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا الأولية المستمدة من الخزعات الورم هو خطوة هامة جدا نحو الطب الشخصي، والانضباط الذي يهدف إلى تحديد أفضل علاج تبعا لاحتياجات المريض الفردية. وسوف يتضمن الخلايا السرطانية المريض محددة معزولة عن المواد الأولية خزعة تسمح في اختبار المختبر من الاستراتيجيات العلاجية. ونظم الاختبار مثل هذه تجعل من الممكن للتحقيق في الأدوية وتركيبات مختلفة منها في الوقت وتوفير التكاليف الإنتاجية العالية الفرز. بالإضافة إلى ذلك، ودمج الخلايا اللحمية المرتبطة الورم كما هو موضح في هذه الدراسة مهمة للنهج شخصية، منذ المكروية تأثيرات الورم ورم تطور 13 و قد يثبت كما suitabالهدف العلاجي جنيه.
بدلا من ذلك إلى نهج شخصية، نموذج الورم لدينا يمكن تعديلها لتكون بمثابة نظام اختبار الورم معمم عن طريق دمج خطوط الخلايا الورمية المعمول بها. هذا هو التكيف واعدة لأغراض البحوث الأساسية. لكل اختبار المخدرات النهج مطلوب وجود بنية الأوعية الدموية لاختبار توزيع وامتصاص المواد العلاجية. مصفوفة-SIS MUC يسمح للالبذر basolateral مع mvEC الأولية للدراسات امتصاص الحاجز، فإن إعادة زرع النبتة من هياكل الأوعية الدموية الحفاظ على BioVaSc زيادة تحسين دراسة تسليم المخدرات.
من أجل خلق نماذج الأنسجة، مصفوفة قابلة للتحلل 3D يمكن استخدامها كإطار لثقافة مشتركة من أنواع مختلفة من الخلايا 14. استخدام مثل هذه المصفوفات 3D غالبا ما تكون محدودة بسبب عدم وجود من الأوعية الدموية وظيفية. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق استخدام BioVaSc، والذي يقدم الحفاظ شارع الأوعية الدمويةuctures، والتي يمكن reseeded مع الخلايا البطانية. علاوة على ذلك، يوفر BioVaSc مكونات الخلية، والتي تضمن التصاق الخلايا والأنسجة تسهيل التمايز. فإنه يمكن أيضا وظيفة الأنسجة فترة طويلة محددة من الأنسجة الحيوي الصناعي 3D 7،8،15. شرط مسبق لهندسة بدائل وظيفية الأوعية الدموية هو محاكاة من الفيزيولوجية البشرية وظروف النشاط الحيوي. لذلك، نظم مفاعل حيوي، والتي يمكن تنفيذ هذه المتطلبات في المختبر، هي من مصلحة المتطرفة لخلق نماذج الورم البيولوجية.
مزيج من BioVaSc، والتكنولوجيا مفاعل حيوي وشارك في زراعة مختلف أنواع الخلايا هي طريقة واعدة جدا لتوليد أنسجة الورم أوعية دموية، والتي سوف تسمح للدراسة الآليات ذات الصلة لتطور سرطان مثل الأوعية الدموية والانبثاث. ونحن نرى مثل هذه النماذج الورم كنهج واعدة لاستكمال الدراسات الحيوانية من خلال توفير ما يعادللعلم وظائف الأعضاء البشرية الورم.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر يناير Hansmann (فراونهوفر مجلس الحبوب العراقي، شتوتغارت) لدعمه التقني لتطوير المفاعلات الحيوية والحاضنة مفاعل حيوي.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
FCS | LONZA | DE14-801F | |
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
peristaltic pump | Ismatec | ||
sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
Versene | Gibco | 15040-033 |