Metoder til at skabe menneskelige 3D tumorvæv som testsystemer er beskrevet. Disse teknologier er baseret på et decellulariserede biologiske vaskulariseret Scaffold (BioVaSc), primære humane celler og tumor-cellelinie, som kan dyrkes under statiske såvel som under dynamiske forhold i en strøm bioreaktoren.
Kræft er en af de førende dødsårsager på verdensplan. Nuværende terapeutiske strategier er overvejende udviklet i 2D kultur-systemer, som ikke er tilstrækkeligt afspejler fysiologiske betingelser in vivo. Biologiske 3D matricer giver cellerne et miljø, hvor celler kan selv-organisere tillader undersøgelse af væv organisation og celledifferentiering. Sådanne stilladser kan podes med en blanding af forskellige celletyper for at studere direkte 3D celle-celle-interaktioner. At efterligne 3D kompleksitet kræftsvulster har vores gruppe udviklet en 3D in vitro tumor testsystemet.
Vores 3D væv test-modeller in vivo situationen af maligne perifere nerve skede tumorer (MPNSTs), som vi etablerede med vores decellulariseret svin jejunal segment afledt biologisk vaskulariseret stillads (BioVaSc). I vores model, vi genpodedes en modificeret BioVaSc matrix med primære fibroblaster, mikrovaskulære endotelceller (mvECs) og S462 tumor cellelinie. Ved statisk kultur, er den vaskulære struktur BioVaSc fjernet, og den resterende stillads er skåret åben på den ene side (lille tarmsubmucosa SIS-Muc). Den resulterende matrix derefter fast mellem to metalringe (celle kroner).
En anden mulighed er at dyrke cellen udsåede SIS Muc i en strøm bioreaktor, der udsætter cellerne for forskydningsspænding. Her bioreaktoren forbundet til en peristaltisk pumpe i et egenproduceret inkubator. En computer regulerer arteriel oxygen og næringsstofforsyning via parametre, såsom blodtryk, temperatur og strømningshastighed. Denne opsætning giver mulighed for en dynamisk kultur med enten tryk-regulerede pulserende eller konstant flow.
I denne undersøgelse kunne vi kunne etablere både en statisk og dynamisk 3D dyrkningssystem for MPNSTs. Evnen til at modellere kræftsvulster i en mere naturlig 3D-miljø vil gøre det muligt opdagelse, afprøvning og validering affremtidige lægemidler i et menneske-lignende model.
Nye lægemidler skal valideres i forhold til deres kvalitet, sikkerhed og effektivitet, før markedsføringstilladelse. Til dato dyreforsøg er standardmetoden for drug test og validering. Men på grund af artsspecifikke forskelle dyreforsøg ofte ikke udtømmende evaluere virkningen af forbindelserne i mennesker 1. Af denne grund er det vigtigt at generere humane væv modeller, der kan anvendes til in vitro-test af nye lægemidler og stoffer.
Et af de centrale punkter i vores gruppe er oprettelsen af in vitro-testmodeller med vores biologiske vaskulariseret stillads (BioVaSc) 2,3. Den BioVaSc kan anvendes som en statisk eller dynamisk 3D matrix system. Ved statisk kultur, er det decellulariserede svine jejunal segment (Small tarmsubmucosa SIS-MUC) placeret i en metalindsats for celle tilsået. Forskellige celler, såsom cancer og endotelceller kan dyrkes på stilladset.
<pclass = "jove_content"> For dynamisk kultur er BioVaSc fastgjort til en bioreaktor, der anvender flow gennem vaskulaturen eller på tværs af overfladen på stilladset. Aktuelle bioreaktorer gennemføre biologiske, mekaniske eller elektriske stimuli, der virker på differentiering eller proliferation af celler 4. For bioreaktorer inden for Tissue Engineering, det grundlæggende koncept er at simulere forholdene i den menneskelige krop. Hvori, celler tilvejebragt et naturligt miljø, hvor de kan interagere med hinanden og deres omgivende ekstracellulære matrix. Til fremstilling af in vitro testsystemer eller transplantationer, evnen til at efterligne det naturlige miljø af celler med en passende bærer struktur og bioreaktor er kritisk 5. Derfor skal mere komplekse og teknisk krævende enheder blive udviklet for at opfylde disse opgaver 6.Det er endvidere muligt at bruge vores stillads til establishment af en vaskulariseret model på grund af de bevarede rørformede strukturer, som omfatter fodring arterie, vene, og den forbinder kapillarleje. Alle svineceller skal fjernes ved kemisk, mekanisk og enzymatisk decellularization og stilladset gamma-steriliseres. De gendannede rørformede karstrukturer kan efterfølgende reseeded med humane mikrovaskulære endotelceller ved hjælp af en recirkulation perfusionsbioreaktor 7, som efterligner de biomekaniske og / eller biokemiske parametre, såsom pH, temperatur, tryk, næringsstofforsyning og renovation 6. Den fornyede endotelialisering af de rørformede strukturer skaber en menneskelig blodkar svarer inden kollagen stillads 3,7. I det følgende trin, kan overfladen af de tidligere lumen (slimhinder) seedes med primære humane celler til at etablere co-kulturer 3,7,8.
I denne undersøgelse en 3D-tumor test systemet er sat op ved co-dyrkning af en tumor cellelinje med primær stRomal celler under statiske og dynamiske forhold på SIS-Muc.
Ved sammenligning af 2D og 3D dyrkningssystemer i tumor forskning, 3D-systemer, på trods af at være dyrere fremgangsmåde har vist sig at efterligne betingelserne i biologiske mikromiljøer bedre. Det kunne påvises, at nogle tumorceller vokser meget langsommere i en 3D-kultur end i et fælles 2D kultur 12, som er i overensstemmelse med den situation, i en reel tumor. Bissell og kolleger viste i deres arbejde, at opførslen af kræftfremkaldende bryst celler afspejler in vivo situation, herunder celle morfologi og signalering, mere præcist, når et 3D-kultur i en matrix tilbyder celle-ECM interaktioner. Desuden har de understregede vigtigheden af det ekstracellulære miljø i 3D ved at vise, at ændringer i de miljømæssige interaktioner førte til reversion af de maligne celler til en normal fænotype. Derudover og vigtigst af alt, kan disse resultater også blive bekræftet i in vivo dyremodeller 10,11.
NDHOLDET "> Den direkte sammenligning af in vivo dyreforsøg og in vitro vævsmodellerne afslører fordele og ulemper i begge systemer. En fordel ved in vitro modeller er det tilladelse af en meget bedre realtid eller fast billeddannelse ved mikroskopi. En begrænsning er, at de efterligner statiske eller kortvarige forhold, hvorimod in vivo systemer ofte fremskridt. Den nuværende mangel på vaskulatur og normal transport af små molekyler, vært immunrespons og andre celle-celle-interaktioner er yderligere ulemper ved in vitro-modeller 12. Derfor 3D in vitro-systemer, som præsenteres i denne undersøgelse giver et lovende supplement til dyreforsøg. De giver en bedre sammenlignelighed for den menneskelige organisme og dermed minimere eksperimentelle fejlfortolkninger. Biomimetic in vivo modelsystemer vil dermed blive mere relevant at undersøge, hvordan kræft og metastatisk spredning er afhængig på microenvironmental betingelser, der regulerer tumorigenesis 11.Vores undersøgelse viser, at 3D-miljø, som SIS-Muc fører til en mere tumor-lignende væv dannelse af celler, der ikke er observeret i den fælles 2D cellekultur (se figur 3A). Endvidere er anvendelsen af primære celler fra tumor biopsier er et meget vigtigt skridt i retning af skræddersyet medicin, en disciplin, der sigter på at identificere den bedste behandling afhængig af patientens individuelle behov. Omfattende primære patient-specifikke tumorceller isoleret fra biopsi materiale vil tillade in vitro afprøvning af terapeutiske strategier. Sådanne testsystemer vil gøre det muligt at undersøge forskellige lægemidler og kombinationer deraf i en tids-og omkostningsbesparende high-throughput screening. Derudover integration af tumorassocierede stromale celler som vist i denne undersøgelse er vigtig for den personlige fremgangsmåde, eftersom en tumor microenvironment påvirkninger tumorprogression 13 og kan vise sig som suitable terapeutisk mål.
Alternativt til en personlig tilgang kan vores tumormodel modificeres til at tjene som en generaliseret tumor testsystem ved inkorporering af etablerede tumorigene cellelinjer. Dette er en lovende tilpasning til grundlæggende forskning. For både narkotika testning nærmer tilstedeværelsen af en vaskulær struktur er nødvendig for at teste distributionen og udbredelsen af terapeutiske stoffer. SIS-Muc matrix tillader basolaterale såning med primær mvEC for barriere optagelse undersøgelser vil tilsået af de bevarede vaskulære strukturer BioVaSc yderligere at forbedre studiet af drug delivery.
For at skabe væv modeller kan en 3D bionedbrydelig matrix blive brugt som ramme for en co-kultur af forskellige celletyper 14. Anvendelsen af sådanne 3D matricer ofte begrænset af manglen på et funktionelt vaskularisering. Dette problem kan løses ved anvendelse af BioVaSc, som tilbyder konserveret blodkar structures, som kan reseeded med endotelceller. Endvidere BioVaSc giver ekstracellulære komponenter, der sikrer adhæsionen af cellerne og lette vævsdifferentiering. Det giver også lang tid væv specifikke funktion bioartificial 3D væv 7,8,15. Forudsætningen for projekteringen af funktionelle vaskulære erstatninger er efterligning af menneskets fysiologiske og biomekaniske forhold. Derfor bioreaktor systemer, der kan implementere disse krav in vitro, er af ekstrem interesse for at skabe biologiske tumormodeller.
Kombinationen af BioVaSc, bioreaktoren teknologi og co-dyrkning af forskellige celletyper er en meget lovende metode til at generere vaskulariserede tumorvæv, som muliggør undersøgelse af mekanismer er relevante for udviklingen af kræft, såsom angiogenese og metastase. Vi ser sådanne tumormodeller som en lovende metode til at supplere dyreforsøg ved at give en tilsvarendetil human tumor fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) for hans teknisk støtte til at udvikle bioreaktorer og bioreaktor kuvøse.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
FCS | LONZA | DE14-801F | |
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
peristaltic pump | Ismatec | ||
sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
Versene | Gibco | 15040-033 |