परीक्षा प्रणाली के रूप में मानव 3D ट्यूमर ऊतकों बनाने के लिए तरीके से वर्णित हैं. इन प्रौद्योगिकियों एक decellularized जैविक vascularized पाड़ (BioVaSc), प्राथमिक मानव कोशिकाओं और एक प्रवाह बायोरिएक्टर में गतिशील परिस्थितियों में के रूप में अच्छी तरह से स्थिर तहत संवर्धित किया जा सकता है, जो एक ट्यूमर कोशिका लाइन, पर आधारित हैं.
कैंसर दुनिया भर में मृत्यु के प्रमुख कारणों में से एक है. वर्तमान चिकित्सकीय रणनीति मुख्य रूप से अपर्याप्त vivo में शारीरिक स्थिति को प्रतिबिंबित जो 2D संस्कृति प्रणालियों में विकसित कर रहे हैं. जैविक 3 डी matrices ऊतक संगठन और सेल भेदभाव के अध्ययन की अनुमति, कोशिकाओं कोशिकाओं स्वयं को संगठित कर सकते हैं जिसमें एक वातावरण प्रदान करते हैं. इस तरह scaffolds प्रत्यक्ष 3 डी सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का एक मिश्रण के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है. कैंसर ट्यूमर का 3 डी जटिलता की नकल करने के लिए, हमारे समूह एक 3 डी में इन विट्रो ट्यूमर परीक्षण प्रणाली विकसित की है.
हमारे 3 डी ऊतक परीक्षण प्रणाली मॉडल हम अपने decellularized सुअर का मध्यांत्रीय खंड व्युत्पन्न जैविक vascularized पाड़ (BioVaSc) के साथ स्थापित किया गया है, जो घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर (MPNSTs), के vivo स्थिति. हमारे मॉडल में, हम प्राथमिक fibroblasts, microvascular endothelial कोशिकाओं (के साथ एक संशोधित BioVaSc मैट्रिक्स reseededmvECs) और S462 ट्यूमर कोशिका लाइन. स्थिर संस्कृति के लिए, BioVaSc के संवहनी संरचना हटा दिया जाता है और शेष पाड़ एक तरफ (छोटा आंतों submucosa सीस-muc) पर खुला कट जाता है. परिणामस्वरूप मैट्रिक्स तो दो धातु के छल्ले (सेल मुकुट) के बीच तय हो गई है.
एक अन्य विकल्प संस्कृति तनाव कतरनी के लिए कोशिकाओं को उजागर करता है कि एक प्रवाह bioreactor प्रणाली में सेल वरीयता प्राप्त सीस-muc है. इधर, बायोरिएक्टर एक आत्म – निर्माण इनक्यूबेटर में एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ा है. एक कंप्यूटर रक्तचाप, तापमान, और प्रवाह की दर के रूप में मानकों के माध्यम से धमनी ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति को नियंत्रित करता है. इस सेटअप दबाव विनियमित काँपने के गुणवाला या निरंतर प्रवाह के साथ या तो एक गतिशील संस्कृति के लिए अनुमति देता है.
इस अध्ययन में, हम सफलतापूर्वक MPNSTs के लिए एक स्थिर और गतिशील 3 डी संस्कृति प्रणाली दोनों स्थापित कर सके. एक अधिक प्राकृतिक 3 डी वातावरण में कैंसर के ट्यूमर को मॉडल करने की क्षमता की खोज, परीक्षण, और सत्यापन के लिए सक्षम हो जाएगाएक मानव की तरह मॉडल में भविष्य फार्मास्यूटिकल्स.
नई दवाइयों उनकी गुणवत्ता, सुरक्षा, और बाजार प्राधिकरण से पहले प्रभावकारिता के संबंध में मान्य होना चाहिए. तिथि करने के लिए, पशु प्रयोगों औषधि परीक्षण और सत्यापन के लिए मानक तरीका है. बहरहाल, कारण प्रजाति विशेष के मतभेदों को, पशु प्रयोगों अक्सर व्यापक मनुष्यों 1 में यौगिकों के प्रभाव का मूल्यांकन नहीं है. इस कारण से, यह नई दवाओं और पदार्थों के इन विट्रो परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि मानव ऊतक मॉडल उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है.
हमारे समूह का ध्यान केंद्रित का एक हमारे जैविक vascularized पाड़ (BioVaSc) 2,3 के साथ इन विट्रो परीक्षण मॉडल की रचना है. BioVaSc एक स्थिर या गतिशील 3 डी मैट्रिक्स प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. स्थिर संस्कृति के लिए, decellularized सुअर का मध्यांत्रीय खंड (छोटा आंतों submucosa सीस-muc) सेल reseeding के लिए एक धातु डालने में रखा गया है. इस तरह के कैंसर और endothelial कोशिकाओं के रूप में विभिन्न कोशिकाओं, चबूतरा पर संवर्धित किया जा सकता है.
<pगतिशील संस्कृति के लिए वर्ग = "jove_content">, BioVaSc vasculature भर या पाड़ की सतह के पार प्रवाह लागू होता है कि एक बायोरिएक्टर प्रणाली से जुड़ा हुआ है. वर्तमान बायोरिएक्टर कोशिकाओं 4 का भेदभाव या प्रसार पर कार्रवाई कि, जैविक, यांत्रिक या विद्युत उत्तेजनाओं लागू. टिशू इंजीनियरिंग के क्षेत्र में बायोरिएक्टर के लिए, बुनियादी अवधारणा मानव शरीर में शर्तों अनुकरण करने के लिए है. जिसमें, कोशिकाओं वे एक दूसरे को और उनके आसपास के बाह्य मैट्रिक्स के साथ बातचीत कर सकते हैं, जिसमें एक प्राकृतिक वातावरण प्रदान की जाती हैं. इन विट्रो परीक्षण प्रणाली या प्रत्यारोपण के उत्पादन के लिए, एक उपयुक्त वाहक संरचना और bioreactor प्रणाली के साथ कोशिकाओं के प्राकृतिक वातावरण नकल करने की क्षमता महत्वपूर्ण है 5. इसलिए, अधिक जटिल और तकनीकी रूप से मांग उपकरणों इन कार्यों 6 को पूरा करने के क्रम में विकसित किया जाना चाहिए.यह establ के लिए हमारे पाड़ उपयोग करने के लिए इसके अलावा संभव हैकारण खिला धमनी, नस, और जोड़ने केशिका बिस्तर शामिल हैं जो संरक्षित ट्यूबलर संरचना, के लिए एक vascularized मॉडल की ishment. सभी सुअर की कोशिकाओं, रासायनिक यांत्रिक और enzymatic decellularization से हटा दिया जाना चाहिए, और पाड़ गामा निष्फल. बहाल ट्यूबलर संवहनी संरचनाओं बाद में पीएच, तापमान, दबाव, पोषक तत्वों की आपूर्ति और कचरे को हटाने के रूप में 6 biomechanical और / या जैव रासायनिक मापदंडों mimics जो एक पुनःपरिसंचरण छिड़काव बायोरिएक्टर 7, का उपयोग मानव microvascular endothelial कोशिकाओं के साथ reseeded किया जा सकता है. ट्यूबलर संरचना का पुन: endothelialization श्लेषजनउत्पादी पाड़ 3,7 के भीतर एक मानव रक्त वाहिनियों बराबर बनाता है. निम्न चरण में, पूर्व लुमेन (म्यूकोसा) की सतह सह संस्कृतियों 3,7,8 स्थापित करने के लिए प्राथमिक मानव कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है.
इस अध्ययन में एक 3 डी ट्यूमर परीक्षण प्रणाली प्राथमिक सेंट के साथ एक ट्यूमर कोशिका लाइन सह संवर्धन द्वारा निर्धारित हैएसआईएस-muc पर स्थिर और गतिशील परिस्थितियों में romal कोशिकाओं.
अधिक महंगा दृष्टिकोण होने के बावजूद ट्यूमर अनुसंधान, 3 डी सिस्टम में 2 डी और 3 डी संस्कृति प्रणालियों की तुलना, बेहतर जैविक microenvironments में परिस्थितियों की नकल सिद्ध कर दिया है. यह कुछ ट्यूमर कोशिकाओं को एक असली ट्यूमर में स्थिति के अनुसार है, जो एक आम 2 डी संस्कृति 12, में से एक 3 डी संस्कृति में बहुत धीमी हो जाना कि दिखाया जा सकता है. बिसेल और सहकर्मियों कैंसरकारी स्तन कोशिकाओं के व्यवहार एक मैट्रिक्स के भीतर एक 3 डी संस्कृति सेल ईसीएम बातचीत प्रदान करता है और अधिक सही है जब सेल आकारिकी और संकेतन सहित vivo स्थिति, दर्शाता है कि उनके काम में पता चला. इसके अलावा, वे पर्यावरण बातचीत में परिवर्तन एक सामान्य phenotype के लिए घातक कोशिकाओं के प्रत्यावर्तन के लिए नेतृत्व का प्रदर्शन है कि 3 डी में बाह्य वातावरण के महत्व पर बल दिया. इसके अतिरिक्त और सबसे महत्वपूर्ण बात, इन परिणामों को भी विवो पशु मॉडल 10,11 में में इस बात की पुष्टि की जा सकती है.
ontent "> vivo में पशु प्रयोगों और इन विट्रो ऊतक मॉडल में प्रत्यक्ष तुलना दोनों प्रणालियों में फायदे और कमियां पता चलता है. इन विट्रो मॉडल में से एक लाभ एक बेहतर वास्तविक समय या माइक्रोस्कोपी द्वारा तय इमेजिंग की अनुमति है. एक सीमा है कि वे में विवो प्रणालियों अक्सर प्रगति, जबकि स्थिर या अल्पकालिक परिस्थितियों की नकल. वाहिका संरचना और छोटे अणुओं के सामान्य परिवहन की मौजूदा कमी,. प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मेजबानी, और अन्य सेल सेल बातचीत में इन विट्रो मॉडल 12 से आगे नुकसान कर रहे हैं इसलिए, 3 डी इन विट्रो प्रणाली में इस अध्ययन में प्रस्तुत के रूप में पशु प्रयोगों के लिए एक आशाजनक अलावा प्रदान करते हैं. वे मानव जीव के लिए एक बेहतर तुलनात्मकता प्रदान करते हैं और इसलिए प्रयोगात्मक गलत व्याख्याओं को कम. Biomimetic विवो मॉडल प्रणाली में इसलिए कैंसर और metastatic प्रसार निर्भर है कि कैसे अध्ययन करने के लिए और अधिक प्रासंगिक हो जाएगा tumorig कि विनियमित microenvironmental शर्तों परenesis 11.हमारे अध्ययन सीस-muc द्वारा प्रदान की 3 डी वातावरण सामान्य 2 डी सेल संस्कृति में नहीं मनाया जाता है जो कोशिकाओं की एक अधिक ट्यूमर की तरह ऊतक गठन, (चित्रा 3 देखें) की ओर जाता है कि पता चलता है. इसके अलावा, ट्यूमर बायोप्सी से व्युत्पन्न प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग व्यक्तिगत दवा, एक मरीज की व्यक्तिगत जरूरतों के आधार पर सबसे अच्छा उपचार की पहचान करने के लिए करना है कि एक अनुशासन की दिशा में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है. बायोप्सी सामग्री से अलग प्राथमिक रोगी विशेष के ट्यूमर कोशिकाओं को शामिल चिकित्सीय रणनीतियों के लिए इन विट्रो में परीक्षण की अनुमति देगा. इस तरह की परीक्षा प्रणाली यह संभव है एक समय और लागत की बचत उच्च throughput स्क्रीनिंग में क्या अलग दवाओं और संयोजनों की जांच करने के लिए कर देगा. एक ट्यूमर microenvironment प्रभावों ट्यूमर प्रगति 13 और suitab के रूप में साबित हो सकता है के बाद से ही, इस अध्ययन में दिखाया गया है ट्यूमर जुड़े stromal कोशिकाओं के एकीकरण, व्यक्तिगत दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण हैLe चिकित्सकीय लक्ष्य.
वैकल्पिक रूप से एक व्यक्तिगत दृष्टिकोण के लिए, हमारे ट्यूमर मॉडल स्थापित tumorigenic सेल लाइनों का समावेश करके एक सामान्यीकृत ट्यूमर परीक्षण प्रणाली के रूप में सेवा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इस बुनियादी अनुसंधान प्रयोजनों के लिए एक आशाजनक रूपांतर है. दोनों दवा परीक्षण के लिए एक संवहनी संरचना की उपस्थिति चिकित्सकीय पदार्थों के वितरण और तेज परीक्षण करने के लिए आवश्यक है दृष्टिकोण. एसआईएस-muc मैट्रिक्स बाधा तेज पढ़ाई के लिए प्राथमिक mvEC साथ basolateral बोने की अनुमति देता है, BioVaSc के संरक्षित संवहनी संरचनाओं के reseeding आगे दवा वितरण के अध्ययन में सुधार होगा.
ऊतक मॉडल बनाने के लिए आदेश में, एक 3 डी biodegradable मैट्रिक्स विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 14 के एक सह संस्कृति के लिए ढांचे के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. ऐसी 3 डी matrices का उपयोग अक्सर एक कार्यात्मक vascularization की अनुपस्थिति द्वारा सीमित है. इस समस्या संरक्षित रक्त वाहिका Str प्रदान करता है जो BioVaSc, का उपयोग करके हल किया जा सकता हैuctures, जो endothelial कोशिकाओं के साथ reseeded किया जा सकता है. इसके अलावा, BioVaSc कोशिकाओं के आसंजन सुनिश्चित करने और ऊतक भेदभाव की सुविधा जो बाह्य घटकों, प्रदान करता है. यह भी bioartificial 3D ऊतकों 7,8,15 की लंबे समय ऊतक विशेष समारोह में सक्षम बनाता है. कार्यात्मक संवहनी के विकल्प के लिए इंजीनियरिंग की शर्त मानव शारीरिक और biomechanical शर्तों की नक़ल है. इसलिए, इन विट्रो में इन आवश्यकताओं को लागू कर सकते हैं जो बायोरिएक्टर प्रणाली, जैविक ट्यूमर मॉडल बनाने के लिए चरम ब्याज की हैं.
BioVaSc के संयोजन, बायोरिएक्टर प्रौद्योगिकी और अलग सेल प्रकार की सह संवर्धन ऐसे angiogenesis और मेटास्टेसिस के रूप में कैंसर की प्रगति के लिए प्रासंगिक तंत्र के अध्ययन की अनुमति देगा जो vascularized ट्यूमर ऊतकों, उत्पन्न करने के लिए एक बहुत ही होनहार विधि है. हम एक बराबर प्रदान करके जानवरों के अध्ययन के पूरक के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण के रूप में इस तरह के ट्यूमर मॉडल देखनेमानव ट्यूमर शरीर क्रिया विज्ञान के लिए.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों बायोरिएक्टर और bioreactor इनक्यूबेटर विकसित करने के लिए अपने तकनीकी सहायता के लिए जनवरी Hansmann (Fraunhofer IGB, स्टटगार्ट) को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
FCS | LONZA | DE14-801F | |
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
peristaltic pump | Ismatec | ||
sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
Versene | Gibco | 15040-033 |