Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Karakterisering av inflammatoriske responser under intranasal kolonisering med streptokokker lungebetennelse

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

Kolonisering av murin nasopharynx med Streptococcus pneumoniae og etterfølgende utvinning av tilhenger eller rekrutterte celler er beskrevet. Denne teknikken innebærer å skylle nasopharynx og samling av væsken gjennom nares og er tilpasningsdyktig for ulike avlesninger, inkludert differensialcelle kvantifisering og analyse av mRNA uttrykk in situ.

Abstract

Nasopharyngeal kolonisering av Streptococcus pneumoniae er en forutsetning for invasjon til lungene eller blodbanen1. Denne organismen er i stand til å kolonisere slimhinnens overflate av nasopharynx, hvor den kan ligge, formere seg og til slutt overvinne vertsforsvar for å invadere til andre vev av verten. Etablering av en infeksjon i normalt nedre luftveier resulterer i lungebetennelse. Alternativt kan bakteriene spre seg inn i blodet og forårsake bakterieemi, som er forbundet med høy dødelighet2, eller ellers føre direkte til utvikling av pneumokokk meningitt. Å forstå kinetikken til, og immunresponser på, nasofaryngeal kolonisering er et viktig aspekt av S. lungebetennelse infeksjonsmodeller.

Vår musemodell av intranasal kolonisering er tilpasset fra menneskelige modeller3 og har blitt brukt av flere forskningsgrupper i studiet av vertspatogenresponser i nasopharynx4-7. I den første delen av modellen bruker vi en klinisk isolering av S. pneumoniae for å etablere en selvbegrensende bakteriekolonisering som ligner på vognhendelser hos menneskelige voksne. Prosedyren som er beskrevet her, innebærer forberedelse av et bakteriell inokulum, etterfulgt av etableringen av en koloniseringshendelse gjennom levering av inoculum via en intranasal administrasjonsvei. Residente makrofager er den dominerende celletypen i nasopharynx under steady state. Vanligvis er det få lymfocytter tilstede hos uinfiserte mus8, men slimhinnekolonisering vil føre til lav- til høygradig betennelse (avhengig av virulensen av bakterielle arter og belastning) som vil resultere i en immunrespons og den påfølgende rekrutteringen av vertsimmunceller. Disse cellene kan isoleres av en lavage av trakealinnholdet gjennom nares, og korrelert med tettheten av koloniseringsbakterier for bedre å forstå infeksjonens kinetikk.

Protocol

Før du begynner: Alle trinn gjøres i et Biohazard Nivå 2 (BSL2) Biologisk Sikkerhetsskap (BSC) med mindre annet er oppgitt. Forsikre deg om at du har fått riktig Biohazard-godkjenning for bruk av smittsomme bakterielle patogener i henhold til institusjonelle retningslinjer før forsøkene startes. I tillegg må du sørge for at du har alle materialer og reagenser som er nødvendige for å utføre prosedyren som er utarbeidet på forhånd. Mus som brukes i disse eksperimentene har inkludert kvinnelige C57BL/6-mus fra Jackson Laboratories, Charles eller Taconic og var 10-14 ukers alder (selv om vi ikke har funnet noen kjønnsavhengige signifikante forskjeller i kinetikk i nesekoloniseringsklaring eller infeksjon). Alle mus som ble brukt i disse eksperimentene ble oppdrettet og vedlikeholdt under spesifikke patogenfrie forhold, og var fri for vanlige virus, (LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV og andre) bakterier (f.eks H. pylori) og parasitter(f.eks. pinworm, ektoparasitter) ved fekal prøvetesting samt hyppig anatomisk vurdering av sentinelmus cohoused i deres rom. Når du utfører disse eksperimentene, anbefaler vi at du bruker kontrollmus som ikke er yngre enn 10-12 uker og ikke eldre enn 6 måneder. Mus yngre eller eldre enn denne aldersgruppen er mer utsatt for lengre nasopharyngeal vogn varighet og økt sannsynlighet for spredning infeksjon. Musebakgrunn er en annen viktig vurdering som kan påvirke resultatene av et koloniseringseksperiment, da flere grupper har vist at mus med forskjellig genetisk bakgrunn har forskjellige følsomheter for S. pneumoniae D39 (serotype 2) stamme9,10. S. lungebetennelse er ikke et naturlig forekommende murinpatogen, og det eneste naturlige reservoaret er den menneskelige nasopharynx. Overføring skjer via respiratoriske dråper, og siden mus ikke produserer respiratoriske sekreter, kan individuelle mus ikke overføre bakterien til andre mus, så det er ingen bekymring for mus-til-mus overføring11. For en visuell oversikt over prosedyrene som er beskrevet i dette manuskriptet, se figur 1.

1. Forberedelse av S. lungebetennelse Kultur

  1. Inokuler 5 ml tryptisk soya agar for suspensjonsveksten av Streptococcus pneumoniae.
  2. Kultur under statiske forhold ved 37 °C i 5 % CO2 til bakteriell inokulum når loggfasevekst med en tilsvarende væsketetthet på 108 CFU/ml som bestemt av en kilometerteller satt til 600 nm. Den nøyaktige avlesningen som tilsvarer denne CFU vil variere avhengig av den spesifikke valgte bakteriestammen; for de fleste stammer av S. lungebetennelse tilsvarer dette et OD600-område på 0,45-0,55. Vanligvis vil S. pneumoniae stammer i flytende kultur vokse til denne tettheten innen 1,5-2,5 timer under de anbefalte forholdene, uten behov for subkultur. Kulturen bør ikke få lov til å vokse (utover en OD-avlesning på 0,75) da dette representerer punktet der bakteriene ikke lenger er i loggfasevekst og gjennomgår omfattende autolyse.
  3. Hver mus vil bli inokulert med ca. 107 bakterier. Derfor, for hver 9 mus som skal koloniseres, pipette 1 ml inoculum i et Eppendorf-rør og spinn på 15.000 x g i 1 min. En hvitaktig pellets skal være synlig. Fjern supernatanten, vær forsiktig så du ikke forstyrrer pelletsen og resuspend bakteriene i 100 μl fosfatbufret saltvann (PBS), og dermed øke konsentrasjonen til 109 CFU / ml. På dette stadiet bør bakteriene forbli levedyktige, men vil ikke lett replikere.
  4. Hvis du bruker flere aliquots, kombiner i ett rør for å kontrollere for små variasjoner mellom prøvene i bakteriell tetthet.
  5. Hold bakterier på is til de er klare for inokulasjon, i maksimalt 1 time.
  6. For å oppnå et eksakt bakterietall, utfør logvis seriell fortynningsserie som starter med pent bakteriell inokulum. Fortynn serielt 10 ganger, og tilsett 10 μl til 90 μl steril PBS.
  7. Plate ut 3 dråper med 10 μl prøver av fortynning 10-5 - 10-9, pluss en PBS-bare forurensningskontroll, på separat merkede deler av tryptisk soya agar (TSA) plate supplert med 5% saueblod (Figur 2). Sørg for at pipettespissene endres for hvert trinn som fortynnes fra en høyere CFU-konsentrasjon til en lavere CFU-konsentrasjon for å unngå å bære over overflødige bakterier og øke variasjonen i resultatene. Humane blodagarplater (HBA) kan også brukes i stedet for TSA. Siden mange stammer av S. lungebetennelse er resistente mot neomycin (fra 5-20 μg / ml), kan dette antibiotika også legges til agarmediet du velger under plateforberedelsesfasen. Dette letter opplisting da det eliminerer ikke-eksisterende bakterier. Den antibiotiske følsomheten til hver stamme må testes på forhånd for å bestemme den optimale konsentrasjonen av antibiotika som skal brukes til hver bakteriestamme.
  8. La tørke i 15-30 min avdekket, dekk deretter plater og plasser opp ned i bakteriell inkubator satt til 37 °C og 5 % CO2. Vokse opp bakteriekolonier på tallerken i 24 timer.
  9. Bestem antall kolonidannende enheter og deres tilsvarende konsentrasjon. Basert på bestemmelsene i OD600-verdien, bør konsentrasjonen være innenfor området 1-4 x 109 CFU / ml. S. lungebetennelseskolonier skal vises som små, sirkulære kolonier en gulaktig beige i farge, med en liten depresjon i midten som gir dem et smultringlignende utseende (Figur 3).

2. Murine intranasal kolonisering

  1. Hold musene tilbake ved å plassere dem i et musebegrensingsapparat (et modifisert 50 ml Falcon-rør med spissen avskåret for å skape en blenderåpning) som sikrer dem ved foten av kroppen med tommelen, slik at nesene deres bare kommer ut av konisk ende av restrainerapparatet (Figur 4). Bruk av dette apparatet tillater immobilisering av musens hode og segregering av nares på en måte som minimerer bevegelse samt hindrer forsøk fra dyret på å makulere pipettespissen, noe som muliggjør fullstendig levering av inokulumet. Alternativt kan mus immobiliseres via scuffing i nakken og manuell selvbeherskelse. Vi anbefaler ikke anestesi av dyrene før intranasal inokulasjon. Administrering av inokulum til dyr under anestesi resulterer i at noe av inokulumet sprer seg til lungene12,13.
  2. Bruk en P10- eller P20-pipette, inokuler hver mus ved å deponere 10 μl av den forberedte kulturen, fordele den jevnt mellom begge nares (la inokulum dryppe inn i nesen ved å pulsere inokuleringen gradvis, ta tid for mus å inhalere inokulum). For å oppnå fullstendig levering av inoculum, pause administrasjon når som helst musen begynner å bevege nesen for mye. Hele inokulumet kan ikke injiseres i nares, da musene kan utvise noen gjennom nesen under utånding; Men ettersom den utviste mengden har en tendens til å være minuscule, og inoculum inneholder en ekstremt høy mengde bakterier, påvirker dette ikke den koloniserende bakteriebelastningen betydelig. I tillegg er overflatearealet som er tilgjengelig for kolonisering i nasopharyngeal slimhinnen begrenset, og derfor har vi og andre funnet ut at den anbefalte 107-dosen er tilstrekkelig til å oppnå konsistente nivåer av bakterier hos alle mus, noe som resulterer i minimal variasjon i innledende mengder koloniserende bakterier14,15 .
  3. Vei mus hvis du bruker vektindikatorer som en del av sluttpunktovervåkingen. Overvåk mus hver 12-24 timer for kliniske symptomer, inkludert sløvhet, ruffled pels og vekttap. Mus vil vanligvis ikke vise symptomer på sykdom før 3-5 dager etter kolonisering, og disse vil gå foran vekttap som kan gjennomsnittlig rundt 5% av total kroppsvekt om dagen. Etter hvert som musene blir stadig sykere, vil de anta hunched holdninger og vise redusert aktivitet og redusert respons på stimulering, inkludert håndtering. På dette stadiet er sykdom vanligvis en indikasjon på sepsis og/eller lungebetennelse og vil sannsynligvis være terminal, selv om mus kan behandles med 1 ml subkutan saltvann daglig for å forbedre resultatene. Overlevende mus bør begynne å vise forbedring etter dag 7 etter kolonisering, som det fremgår av stabilisering av vekt etterfulgt av vektøkning, selv om forskjellige stammer av S. lungebetennelse kan indusere sykdom raskere og resultere i progresjon av kliniske symptomer langs en annen tidslinje. Se figur 5 for et representativt resultat av vekt sporet hos mus kolonisert med P1547-stammen.

3. Eksempelsamling for neseskylling

Før du begynner: Lag kanylerte nåler med 1 ml sprøyter avkortet med 26 3/8 G skrå kanyler. Klipp 2,5 cm stykker PE20 polyetylenrør med en indre diameter 0,38 mm, og sørg for at hver ende har en skrå spiss. Bruk tang, skyv et 2,5 cm langt stykke PE20 polyetylenrør (indre diameter 0,38 mm) på nålespissen, og unngå å punktere rørsiden. Kanylerte nåler kan holdes i 70% etanol til nødvendig.

  1. Euthanize eksperimentelle mus. Siden cervical dislokasjon potensielt kan skade luftrøret, må denne metoden for eutanasi unngås. Vår foretrukne metode er isofluranbedøvelse etterfulgt av ekssanguinasjon, men sørg for at du følger institusjonelle retningslinjer når du velger modus for eutanasi.
  2. Bruk 70% vandig etanol, steriliser dyrets superoanteriorpels, spesielt nakken, og pass på å forhindre at etanol får tilgang til nares.
  3. Lag et enkelt langsgående kutt langs midtlinjen av dyrets hals, og to horisontale kutt i hver ende, og skape en åpning for å forestille seg luftrøret.
  4. Skrell huden forsiktig tilbake til hver side, og avsløre nakkevev under.
  5. Luftrør skal være synlig, omgitt av langsgående muskler på hver side. Klipp forsiktig disse for å gi en klar utsikt over luftrøret selv, pass på at du ikke kutter den omkringliggende vaskulaturen.
  6. Hvis vaskulaturen ble kuttet og blod er til stede, før du fortsetter, la blødningen stoppe, og rengjør deretter området flere ganger ved å dispensere steril PBS og bruke steril gasbind for å forsiktig suge opp overflødig fuktighet i området.
  7. Når luftrøret er riktig eksponert, gjør du et tverrgående, semilunarsnitt i luftrøret omtrent halvveis opp (figur 6).
  8. Trekk opp 1000 μl sterilisert PBS i tidligere tilberedt kanylerål.
  9. Sett kanylen inn i luftrøret mot nesen, og hold skråkanten pekende nedover for enkel innsetting (Figur 7). Når nålen er på plass, roterer du den 180°, og sonderer forsiktig oppover til du føler lys motstand.
  10. Plasser Eppendorf som er beregnet på prøvetaking like under musens nese.
  11. Test riktig plassering av nålen ved å dispensere en minimal (~ 20 μl) mengde PBS-lavagevæske - dråpe væske skal dannes rundt musens nares; Hvis dette er tilfellet, går du videre til trinn 3.13).
  12. Hvis test PBS dukker opp direkte ut av dyrets munn, trekk kanylen tilbake, og reposisjoner ved igjen forsiktig å undersøke fremover til det er følt svært liten motstand - pass på at du ikke skyver kanylen for langt forbi denne motstanden, da du vil flytte den forbi nesepalmen og gjennom til munnhulen.
  13. Dispenser innholdet i nålen raskt for å bidra til å fortrenge og samle maksimal mengde celler - innholdet skal strømme ut gjennom musens nares og inn i oppsamlingsrøret. Sett prøven umiddelbart på is.
  14. For å samle prøver for RNA-analyse, gjenta trinn 3,8-3,13) ved hjelp av en kanylert nål som inneholder 500 μl RNA lysisbuffer på samme mus. Dette vil tillate innsamling av lysatprøve fra de resterende cellepopulasjonene, i stor grad sammensatt av nasopharyngeal mucosal epitel, da ikke-adherente celler burde ha blitt fjernet etter den første PBS-lavage. Vær oppmerksom på at RNA lysis buffer vil benekte epitelet og ødelegge omkringliggende vev, så det må tas hensyn til å unngå kontakt med organer som lungene, hvis oppbevaring av disse vevene er ønsket. Når den er samlet inn, plasser prøven i RNA lysisbuffer direkte på tørris for å smekke. En gang i lysisbufferen kan prøver lagres i henhold til produsentens instruksjoner, og er stabile vanligvis ved -70 °C i flere måneder.

4. Bestemmelse av bakteriell belastning i Nasopharynx

  1. Kvanter bakterier ved å forberede en seriell fortynningsserie for hver murine neseskyllingsprøve. Generelt kan bakteriebelastning forventes å være mellom 0-104 CFU, og utfører derfor tre 10 ganger serielle fortynninger. Tilsett 10 μl av den pene neseskyllingsprøven (100 CFU/ml) til det første røret til en konsentrasjon på10-1 CFU/ml. Vortex grundig.
  2. Del bakteriologisk plate i kvadranter, og merk kvadranter hver medet medlem av fortynningsserien (10 0-10-3 CFU / ml). Plate ut 3 dråper av 10 μl prøver av de 3 fortynning og den pene prøven på tryptisk soya agar plater supplert med 5% saueblod, som i figur 2.
  3. La tørke i 15-30 min avdekket, dekk deretter plater og legg opp ned i bakteriell inkubator med optimale forhold for bakterievekst (vanligvis 37 °C og 5 % CO2).
  4. Vokse opp bakteriekolonier på tallerken i 18-24 timer.
  5. Bestem antall koloniserende bakterier ved å beregne gjennomsnittet av koloniene som er dannet på tallerken for hver fortynning (figur 3). Figur 8 viser bakteriell tetthet under forskjellige tidspunkter, som bestemt av kultur av neseskylling, hos mus kolonisert med 3 forskjellige stammer av S. lungebetennelse i opptil 21 dager.

5. Forberedelse av prøver for Flow Cytometery

Før du begynner: Forbered blanding av antistoffer. For kvantifisering av leukocyttpopulasjoner anbefaler vi følgende blanding ved de angitte fortynningene: PE-Ly6G (klone 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (klone AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (klone 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (klone PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5,5-CD11c (klone N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (klone M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (klone 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (klone GK1,5, 6,67 μg/ml). Vær oppmerksom på at denne blandingen er 2x konsentrasjon (se trinn 5.5). Alle antistoffer skal fortynnes i FACs Vaskebuffer (0,5% fosterkalvserum, 2mM EDTA, 0,1% natriumazid i PBS) som også bør tilberedes på forhånd. I en blanding av isotype matchet kontroll antistoffer, ideelt sett fra samme leverandør som de merkede antistoffene og i samme konsentrasjoner som de spesifikke antistoffene, bør utarbeides. Prøvene som behandles med isotypekontrollantistoffene vil fungere som den negative kontrollen. All fluorescens observert i prøvene som behandles med isotypekontrollantistoffene, bør betraktes som bakgrunn.

  1. Prechill en sentrifuge som er i stand til å spinne 1,5 ml Eppendorf rør til 4 °C.
  2. Sentrifuge neseskyllingsprøver ved 2000 x g i 10 min ved 4 °C. Rør forsiktig ut supernatant og reserver. Merk: På grunn av den lille mengden celler i nasopharynx, vil cellepelletsen ikke være synlig med mindre det er uønsket rød blodlegemeforurensning, som vil lyse rødt. Hvis dette blir sett, bør prøven kastes.
  3. Resuspend prøve i 50 μl av Fc? RIIb/CD16-2 (2,4 G2) antistoff (som binder Fc-reseptorer og reduserer ikke-spesifikk antistoffbinding) i FACs vaskebuffer i en konsentrasjon på 4 μg/ml.
  4. Inkuber prøve på is i 30 min.
  5. Tilsett 50 μl prepreparert 2x konsentrert fluorescerende antistoffblanding for å prøve. Sett til side et representativt utvalg fra hver eksperimentell gruppe for å fungere som en isotypekontroll. Tilsett isotype antistoffblandingen i denne prøven i stedet for flekkblanding.
  6. Inkuber prøve på is i 1 time.
  7. Sentrifugeprøver ved 2000 x g i 10 min ved 4 °C. Kast supernatant og resuspend i 200 μl PBS.
  8. Gjenta trinn 5.7.
  9. Etter den andre vasken, sentrifuge prøver igjen på 2000 x g i 10 min ved 4 °C.
  10. Resuspend i enten i PBS (hvis du kjører prøve umiddelbart) eller 2% paraformaldehyd (hvis du kjører prøver 1-3 dager etter farging).
  11. Ved gjennomføring av strømningscytometri samler maksimal mengde hendelser per prøve eller til hele prøven er aspirert. I uinfiserte, sunne, unge mus vil dette være så lite som 1000-2000 totale hendelser; Under en bakteriell koloniseringshendelse kan dette tallet øke mer enn 2 til 5 ganger avhengig av sykdomsstatus hos dyr og faktorer som alder og genetisk bakgrunn. Figur 9 viser representative flytcytometriresultater samlet inn fra et 3-laser Becton Dickenson LSRII strømningscytometer ved hjelp av en Forward Scatter på 450 og Side Scatter på 300, selv om vi anbefaler å optimalisere parametere for det spesifikke strømningscytometeret du har tenkt å bruke før prøveinnsamling. Merk: Hvis en prøve inneholder jevne spormengder av blodforurensning, vil de totale hendelsene som samles inn være betydelig høyere enn forventet, og prøven bør diskonteres fra analyse.

6. Kvantitativ PCR (qPCR) analyse av nese lavager

  1. Tine celle lyser fra trinn 3.14 romtemperatur.
  2. Følg den anbefalte protokollen som følger med den foretrukne RNA-ekstraksjonen du ønsker.
  3. Når du har fullført RNA-ekstraksjonsprosedyren som instruert, kvantifiserer du mengden RNA ved hjelp av et spektrofotometer eller elektroforesebasert metode (figur 10). Vi oppnår rutinemessig mellom 975 og 3250 ng totalt RNA per prøve med et forhold på 260/280 nm på >1,7 eller et RNA-integritetsnummer (RIN) rundt, 8,1±0,13.
  4. Transkriber cDNA ved hjelp av M-MULV Reverse Transcriptase i henhold til produsentens protokoll med 1000 ng RNA (maksimum 13 μl).
  5. Fortynn resulterende cDNA-prøver 8x, og aliquot like i 4 separate rør for langvarig lagring ved -20 eller -80 °C.
  6. For å måle genuttrykk ved qPCR, lag 25 μl prøvereaksjoner i triplikat på is eller kald blokk som inneholder: 12,5 μl 2x qPCR master mix fra qPCR-sett etter eget valg, 0,25 μl referansefargestoff, 2 μl fortynnet cDNA (trinn 7,5), 1 μl blandede forover og reversprimere (400 nM endelig), 9,25 μl RNAse-DNAse fritt vann. Denne protokollen er en tilpasning av tidligere publiserte metoder16.
  7. Generelt finner vi at en to-trinns qPCR-forsterkning ( 95 °C i 10 minutter etterfulgt av opptil 40 sykluser x [95 °C x 15 sek, 60 °C x 1 min]) er effektiv (Figur 11a); Hvert primerpar må imidlertid optimaliseres. Dissosiasjonskurver (smeltende) må utføres etter forsterkning for å sikre at det ikke forekom noen ikke-spesifikk forsterkning. forsterkning (figur 11b)
  8. Vi kjører rutinemessig standardkurver for hvert gen som analyseres, samt en standard kalibrator (avledet fra lunge- eller milthomogenat) for hver 96-brønnsplate som analyseres. Relative transkripsjonsmengder oppnås ved først å normalisere rå syklusterskelverdier (Ct) ved referansefargen og transformere de resulterende verdiene gjennom den respektive standardkurven. Disse relative mengdene normaliseres deretter til standardkalibrator og et rengjøringsgen, der det er aktuelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 representerer et oversiktsskjema som oppsummerer hovedtrinnene i protokollen. Figur 2-3 gir visualisering av den mikrobiologiske metodikken som ligger i protokollene som er beskrevet her. Figur 4 representerer riktig posisjonering av en mus for å utføre en intranasal kolonisering, mens figur 5 skildrer typisk endringer i vekten av mus kolonisert med S. pneumoniae stamme P1547. Figur 6-7 representerer spesifikke stadier av neseskyllingsdelen av prosessen, for assistert visualisering av disse to teknikkene. Figur 8-11 består av representative resultater av analyser utført på prøver samlet inn fra nasopharynx av en mus etter neseskylling. Spesielt er figur 8 et representativt resultat av bakteriell belastning i nasopharynx, som bestemt gjennom dyrking av neseskylling oppnådd fra mus kolonisert enten med S. pneumoniae stamme P1121, P1547 eller P1542. Figur 9 representerer cellefenotyping av isolerte nasofaryngeale immunceller ved hjelp av strømningscytometriske teknikker. Figur 10-11 viser representative resultater knyttet til ekspresjonell analyse av nasofaryngeal mRNA via kvantitativ PCR.

Figure 1
Figur 1. Flytskjema over intranasal inokulasjon og neseskylling celleisolasjon prosedyrer ved hjelp av en musemodell. Først er bakteriene forberedt på inokulasjon, og deretter gitt til murinpersoner intranasalt. Etter ønsket tid går, mus euthanized via terminal blødning, og deres nasopharyngeal celler er isolert via to neseskylling trinn: en PBS vaske trinn etterfulgt av en sekundær vask i RNA lysis buffer. Cellene fra den foreløpige PBS-vasken er isolert og analysert ved hjelp av strømningscytometriteknikker, mens RNA isolert fra den andre prøven kan brukes til å undersøke de relative overflodene av molekyler av interesse på transkripsjonsnivå.

Figure 2
Figur 2. For å bestemme bakteriekonsentrasjonen er 10 μl dråper belagt i triplikat på en plate delt inn i seksjoner som representerer en annen seriell fortynning. Disse dråpene får da tørke og platene inkuberes over natten ved 37 °C, 5 % CO2.

Figure 3
Figur 3. Konsentrasjon av streptokokk lungebetennelse isolert fra nasopharynx av et representativt dyr. Hver diskret koloni representerer en kolonidannende enhet, hver samling av kolonier representerer en 10 μl dråpe (belagt i triplikater) og hver kvadrant på platen representerer en separat seriell fortynning. Bakteriekonsentrasjonen bestemmes i CFU/ml ved å beregne gjennomsnittlig antall tellbare, fullt dannede kolonier innenfor, og deretter mellom, kvalifiserte kvadranter.

Figure 4
Figur 4. Bevegelsen av enhver mus som skal inokulere må minimeres, spesielt i nakken, for å muliggjøre riktig levering av bakteriell inokulum. For å oppnå dette er subjektmusen begrenset i et modifisert begrensningsapparat som består av et 50 ml Falcon-rør med blenderåpning i den koniske enden. Musen er deretter plassert slik at nesen kommer ut av blenderåpningen, hvor den kan nås av forskeren, slik at intranasal inokulasjon kan utføres.

Figure 5
Figur 5. Vekt av mus kolonisert med stamme P1547 fra minst 2 representative eksperimenter sporet daglig etter innledende inokulasjon (n = 6) for å skildre typiske endringer i vekt forventet etter nasofaryngeal kolonisering. Vekt vises som en prosentvis endring av startvekten. Vær oppmerksom på forventet kraftig innledende vekttap sett mellom dag 3-5, etterfulgt av stabilisering og gradvis økning i vekt i overlevende mus.

Figure 6
Figur 6. Ved trakeal eksponering fjernes flanke langsgående muskler forsiktig før trakeal snitt på en måte som ikke alvorliger de omkringliggende blodårene. Et lite semilunar snitt blir deretter gjort halvveis opp i luftrøret ved hjelp av fin kirurgisk saks. Det er viktig å kutte gjennom diameteren på luftrøret bare delvis, slik at det er intakt bakre.

Figure 7
Figur 7. Innsetting av den kanylerte nålen i trakealåpningen oppover mot nesen. Når kanylen er på plass, sonder forsiktig til motstanden er oppfylt, og skyll deretter innholdet ut gjennom nares.

Figure 8
Figur 8. En representativ serie bakteriell belastning isolert fra nasopharynx ved hjelp av neseskyllingsprosedyren beskrevet etter kolonisering av C57BL/6 mus (trekanter) med S. pneumoniae stamme P1547 (A), P1542 (B) eller P1121 (C). En komparativ kolonisering av BALB/C-mus (sirkler) etter P1121-kolonisering vises også i (C). Ulike tidspunkter vises i løpet av koloniseringen, inkludert dag 3, 7, 14 og 21. Generelt forventes en høy innledende belastning på dag 3, med liten reduksjon på dag 7. Clearance er vanligvis initiert av dag 14, med full eller nesten full klaring bevist av dag 21 etter kolonisering med de fleste stammer. Klikk her for å vise større figur.

Figure 9
Figur 9. Representativt histogram (A) og prikkplott (B) av totale celler isolert fra murine neseskylling som analysert av strømningscytometri. Differensialuttrykket av markører på cellepopulasjoner gjør det mulig å identifisere leukocyttundergrupper ved bruk av fluorescerende antistoffer rettet mot disse proteinene. Som vist her, merkes leukocyttpopulasjoner ved først å stirre på enkeltceller ved hjelp av en Fremover punktdiagram (område) kontra Fremover punkt (bredde) gate (A), og deretter berike for CD45+ celler i dette delsettet (B). Denne populasjonen kan videre deles inn i bestemte celletyper ved å bruke CD11b og Ly6G dobbeltpositive nøytrofiler (C). Analyse av CD11b- populasjonen kan utføres for å avsløre F4/80+, CD11b-makrofager (D) eller CD11b-, CD3- og CD4 dobbeltpositive CD4 T-celler (E). Cellepopulasjoner kan fenotypes så lenge de uttrykker enten en, eller en kombinasjon av flere unike overflatereseptorer som kan brukes til å skille dem fra andre celletyper. Klikk her for å vise større figur.

Figure 10
Figur 10. Representativt elektroferogram etter elektroforese automatisk sekvensering av en prøve isolert fra murin neseskylling. Det resulterende elektroferogrammet viser mengdedataene og den karakteristiske signaturen til en total RNA-prøve av høy kvalitet avledet fra nasopharyngeal-regionen. Ved analyse av total RNA brukes områdene under RNA-toppene for de to store ribosomale RNA, 18S og 28S, til å beregne tilsvarende forhold. Betydelige endringer i forholdet mellom topper som kan tilskrives 18S og 28S er vanligvis en indikasjon på degradert RNA. Graden av nedbrytning kan oppsummeres av RNA-integritetsnummer (RIN); RIN for dette representative utvalget er 8.1. Et eksempel på svært degradert RNA vises i henholdsvis (B) og (C), og den etterfølgende RIN er henholdsvis 1,9 og 4,6. Klikk her for å vise større figur.

Figure 11
Figur 11. Forsterkningsplott (A) og dissosiasjonskurve (smelting) (B) fra qPCR-analyse av nesevaskcellelysater, som gir et eksempel på hvordan disse to avlesningene vanligvis skal se ut etter en effektiv og korrekt påvist forsterkning av mRNA-produkter isolert fra murin nasopharynx. Representert er en standardkurve for rengjøringsgenet 18S. Resultatene som vises i (A) viser ønsket PCR-produkt etter forsterkning ved hjelp av primere mot GAPDH. Linjen representerer syklusterskelen (Ct). Punktet der forsterkningsplottene som tilsvarer forskjellige prøver krysser denne terskelen, gjør det mulig å sammenligne på tvers av prøver, med lavere verdier som tilsvarer høyere mengder RNA av interesse som finnes der. Plottet i (B) viser at den maksimale smeltetemperaturen til qPCR-produktet er 85 °C, og at det ikke finnes forurensende produkter i denne reaksjonen, noe som vil dukke opp som en ekstra topp atskilt fra ønsket produkttopp. Klikk her for å vise større figur.

Navn på strekk Serotype Virulens Dødelighet hos mus Forventet koloniseringsvarighet
P1121 23F Asymptomatisk 0% 21-28 dager
P1542 4 lav 0-20% 21-28 dager
P1547 6A midt 20-50% 14-21 dager
D39 2 høy 70-100% 14-21 dager

Tabell 1. En tabell over 4 vanlig anvendte S. pneumoniae kliniske isolere stammer, deres tilsvarende serotype nummer, assosiert grad av virulens, forventet andel av invasivitet innenfor en kolonisert undergruppe av mus og typisk varighet av en nasopharyngeal kolonisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien presenterte vi detaljerte metoder for intranasal kolonisering av mus ved hjelp av en klinisk isolerende stamme av Streptococcus pneumoniae og den påfølgende isolasjonen og karakteriseringen av immuncellene rekruttert til nasopharynx som svar på bakteriene. Vi demonstrerte hvordan et bakteriell inokulum kan dyrkes i næringsrike medier og brukes til å etablere en koloniseringshendelse hos mus, som i utgangspunktet er begrenset til nasopharynx. Vi viste da hvordan responderende immuncelletyper som rekrutteres til nasopharynx kan isoleres etter trakeal eksponering, snitt og neseskylling ved bruk av en kanylert nål. Neseskyllingsprøver kan samles inn i PBS for å isolere intakte, lett tilhengerceller; RNA fra tettere adherentceller og omkringliggende epitel-mukosalt lag kan isoleres ved å påføre en sekundær vask som består av RNA lysisbuffer. Den tidligere av disse prøvene kan deretter brukes til å fenotype de spesifikke cellene som rekrutteres i sammenheng med koloniseringen via strømningscytometriteknikker, mens sistnevnte kan brukes på Q-PCR-analyse, for å bestemme effektorfunksjonene til disse rekrutterte cellene ved å se på transkripsjonsuttrykket til immunregulatorer av interesse. Neseskyllingsprøver kan i tillegg brukes til å bestemme kinetikken til clearance av en bakteriell koloniseringshendelse som sammenligner forskjellige eksperimentelle grupper for å ta opp spesifikke forskningsspørsmål.

Utnyttelse av denne metoden for intranasal kolonisering tillater etablering av en koloniseringshendelse som i utgangspunktet er begrenset til dyrets nasopharynx. Enhver etterfølgende spredning av bakteriene til blodet eller organene oppstår derfor sekundært til brudd i immunforsvaret lokalisert i nasopharyngeal slimhinnen. Den trinnvise progresjonen oppnådd gjennom denne modellen gjenspeiler mer nøyaktig prosessen med pneumoccocal invasjon hos mennesker, slik at man kan studere dynamikken mellom koloniseringsbakteriene og vertsslimhinnen - og kanskje bedre forstå endringer i bakteriell patogenitet og / eller vertsimmunitet som muliggjør utvikling av spredningssykdom. Dette er i motsetning til modeller som gir avkall på etableringen av en innledende koloniseringshendelse og velger å studere invasiv sykdom isolert gjennom direkte levering av bakteriell inokulum til lungene via intratrachael instillasjon, til blodet via vaskulær injeksjon eller til bukhinnen via peritoneal injeksjon.

Å gjennomføre en PBS neseskylling etter en koloniseringshendelse muliggjør isolering av ikke- eller mildt tilhengerceller rekruttert til nasopharynx, samt eventuelle mukosalt assosierte bakterier. Det skal imidlertid bemerkes at denne teknikken er begrenset, da den ikke vil frigjøre celler eller bakterier som har reist mellom eller under epitelet, og det vil heller ikke tillate høsting av celler eller bakterier som har lokalisert til nese-assosiert lymfoidvev (NALT), et lymfoidorgan som har blitt rapportert å være et potensielt infeksjonssted etter en pneumokokkkolonisering17,18. Hvis videre studier av NALT er ønsket, anbefaler vi mikrodesisseksjon og fjerning av dette vev engros for studier etter PBS neseskylling; da disse to teknikkene ikke utelukker hverandre, kan de utføres på samme dyr. På grunn av RNA-høsttrinnets lytiske og destruktive natur (sekundært lavage ved hjelp av RNA lysisbuffer), bør dette trinnet utelates hvis det er tenkt å høste NALT. Selv om neseskyllingen er en mindre teknisk utfordrende prosedyre, for grupper som ønsker å oppnå en mer omfattende vurdering av bakteriell belastning som ikke bare inkluderer mucosally-assosierte bakterier, men også de som har invadert nasopharyngeal vevet, foreslår vi å høste nasopharyngeal vev etter fjerning av øvre skalleben av koloniserte mus og disseksjon av vevet i nesekonchae, som beskrevet av andre19.

Arten av en fremkalt immunrespons er avhengig av samspillet mellom vert og patogen. Over 90 serotyper av S. lungebetennelse har blitt karakterisert til dags dato, alle med forskjellige nivåer av patogenitet og virulensfaktoruttrykk, noe som resulterer i differensialprevalens i den menneskelige befolkningen20-23. På samme måte, hos mus, har det blitt rapportert at omfanget av, og kinetikk forbundet med, immunresponsen som fremkalles som svar på en nasopharyngeal kolonisering, er avhengig av koloniseringsstammen selv24. Dermed er valg av en passende belastning å bruke for etablering av en nasopharyngeal kolonisering ikke en triviell sak, og heller ikke valg av musegenetiske bakgrunn. Figur 8 inneholder eksempeldata som skildrer kinetikken ved clearance av en nasofaryngeal kolonisering fra 3 forskjellige S. pneumoniae stammer etter intranasal kolonisering av kvinnelige mus på en C57BL /6 bakgrunn. Tabell 1 gir en oversikt over graden av virulens og lengden på koloniseringstiden som forventes (når den brukes på C57BL/6-bakgrunnen) med 4 S. pneumoniae kliniske isolerende stammer beskrevet i litteraturen og kjent for å være i stand til å etablere en nasofaryngeal kolonisering25: avirulent P1121 (serotype 23F)26,27 lav-virulens P1542 (serotype 4)28, midt-virulens P1547 (serotype 6A)29-31, og den mye brukte, godt karakterisert, svært virulente D39 (serotype 2)32-36. Hvis det eksperimentelle målet er å studere en asymptomatisk nesekoloniseringshendelse uten tilhørende bakteriell formidling til andre vev, anbefaler vi bruk av den avirulente P1121-stammen, som karakteriseres som en potent kolonisator, da lengre koloniseringshendelser (opptil 28 dager før observert klaring) er et kjennetegn på denne stammen. Vanligvis mus kolonisert med P1121 vil ikke kjøre noen risiko for invasiv sykdom og vil ikke vise noen kliniske indikatorer på sykdom (med unntak av midlertidig vekttap). Resten av stammene bør brukes avhengig av ønsket grad av virulens og tilhørende dødelighet, med virulens tatt for å bety ikke graden av infeksjon som utvikler seg i en individuell mus, men snarere andelen mus som viser kliniske tegn på sykdom. Det skal også bemerkes at vanligvis korrelerer graden av virulens omvendt med lengden på koloniseringsvarigheten, med mer virulente stammer som koloniserer i en kortere periode. Alle de 3 av de beskrevne virulente stammene fører til dødelighet hos mus på grunn av, oftest, sepsis, med fulminant lungebetennelse, eller samtidig lungebetennelse og sepsis som utvikler seg i en undergruppe av mus. Forskjellene i lokalisering av invasive bakterier kan være belastningsspesifikke, da det tidligere har blitt rapportert at visse stammer viser tropismer for bestemte organer37. I en liten prosentandel av dyrene kan spontan meningitt også utvikle seg etter kolonisering. Bestemmelse av dødsårsak, samt grad av invasivitet, kan oppnås via innsamling av assosiert vev (lunger, milt og /eller hjerne) fra dyr ved endepunkt. Homogenisering av disse vevene og påfølgende plating kan indikere tilstedeværelse av invasive bakterier og tilsvarende titres.

Et eksempel på en bakteriell kulturtetthets kvantifisering er vist i figur 3. Hvis kulturen er for konsentrert, vokser koloniene for tett til å telles individuelt, men kolonier avledet fra enkeltceller kan skille seg ut hvis en logvis fortynningsserie er belagt. Plating tre tekniske repliker per fortynning minimerer variasjon. Vær oppmerksom på at når man kvantifiserer bakterier hentet fra en nesekoloniseringshendelse, kan man støte på kokulturerte forurensninger, som representerer andre bakteriearter som samtidig er isolert fra murin nasopharynx. Hvis bakteriestammen av interesse har noen kjente antibiotikaresistenser (for eksempel er mange stammer av S. lungebetennelse resistente mot gentamycin eller neomycin opptil 5 μg / ml), kan man minimere forekomsten av forurensninger ved å supplere vekstmediet med antibiotika ved en passende konsentrasjon, og dermed begrense forurensningsveksten.

Flowcytometri kan brukes til å analysere celleoverflatemarkører på neseskyllingsprøver. For eksempel, for analyse av celletyper rekruttert i sammenheng med en infeksjon, kan en blanding av antistoffer som er spesifikke for brutto differensiering av leukocytter, inkludert makrofager (F4/80+), nøytrofiler (CD11b+ og Ly6G+) og T-celler (CD3+ og CD4+ eller CD8+), brukes som tidligere publisert . Videre kan disse analysene kombineres med strømningscytometrisk analyse utført på forskjellige vev eller blod, for bedre å forstå immuncellehandel i løpet av en infeksjon. På grunn av det begrensende antallet celler (vanligvis nummerering i de lave tusenene) som kan isoleres fra nasopharynx, er det vanligvis utfordrende å identifisere sjeldne delsett, selv om forskere som ønsker å oppnå dette, bør vurdere å samle prøver fra flere mus for å oppnå ønsket celleantall. Videre, fordi et begrenset antall celler kan trekkes ut fra denne regionen, anbefaler vi å analysere disse dataene med hensyn til totale celletall.

Selv om proteinuttrykksnivåene vanligvis er lave i nasopharynx som begrenser muligheten for å analysere proteinproduksjon, er det mulig å analysere produksjonen av vertsmolekyler som svar på koloniseringsbakteriene på RNA-nivå. For å oppnå dette kan neseskylling utføres ved hjelp av RNA lysis buffer i stedet for PBS, noe som muliggjør analyse av genuttrykk. For qPCR-forsterkningsdeteksjon er det viktig å kjøre en tilsvarende dissosiasjonskurve (figur 11) for å sikre at riktig og ønsket produkt ble oppdaget. Dette skyldes det faktum at analysen vil oppdage ethvert dobbeltstrenget DNA, inkludert primer dimers, forurensende DNA og PCR-produkt fra misannealed primer.

Vi håper metodene som er beskrevet her vil oppmuntre deg til å bruke en intranasal koloniseringsmodell for å studere vertsresponser på patogener som er viktige i sammenheng med denne undervurderte regionen. For visse menneskelige patogener, som S. pneumoniae, fungerer en tidligere nasopharyngeal koloniseringshendelse som en viktig forløper for påfølgende bakteriell formidling og den dødelige oppfølgeren som kan følge, inkludert forplantning i lungene, noe som kan føre til lungebetennelse, ellers til blodet, og resulterende bakterie og septisk sjokk. Dermed, ved å studere bakteriell kolonisering i denne regionen, kan vi forstå bedre hvordan vi kontrollerer det og forhindrer at mer alvorlig patologi oppstår helt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Dr. Jeffery Weiser ved University of Pennsylvania for hans gave av de kliniske stammene av Streptococcus pneumoniae. Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Institutes for Health Research. CV ble finansiert av et M. G. DeGroote-stipend og et fellesskap fra Canadian Thoracic Society. Dette arbeidet ble finansiert av Ontario Lung Association og Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Arbeidet i Bowdish-laboratoriet støttes delvis av Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research og McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  3. McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
  4. Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
  5. van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
  6. Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
  7. Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
  8. McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
  9. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
  10. Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
  11. Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  12. Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
  13. Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  14. Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
  15. Wu, H. -Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  16. Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
  17. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
  18. Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
  19. Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
  20. Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
  21. Bryant, W. P., J,, et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  22. Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
  23. Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
  24. Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
  25. Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  26. Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
  27. Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
  28. Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
  29. Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
  30. Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
  31. Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
  32. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  33. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  34. Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
  35. Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
  36. Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
  37. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  38. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
  39. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).

Tags

Immunologi Utgave 83 Streptococcus pneumoniae Nasal lavage nasopharynx murine flow cytometri RNA Kvantitativ PCR rekruttert makrofager nøytrofiler T-celler effektorceller intranasal kolonisering
Karakterisering av inflammatoriske responser under intranasal kolonisering med <em>streptokokker lungebetennelse</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, … More

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter