마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화
Summary
이 문서에서는, 우리는 분리와 생쥐 췌장에서 배양 기본 췌장 포상 세포에 대한 신속하고 편리하게 절차를 설명합니다. 이 방법은 신선한 차 변환되지 않은 정상 / 외분비 췌장 세포의 생리학을 연구하는 귀중한 방법을 구성합니다.
Abstract
이 프로토콜은 가능한 일주일 이상 그들의 문화를 유지하고, 생쥐 췌장 acini의 신속한 분리 (이하 HR)에서 허용합니다. 20 개 이상 X 10 6 포상 세포는 하나의 쥐 췌장에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 독립적으로 병렬로 많은 10 췌장을 처리 할 수있는 가능성을 제공합니다. 이 포상 구조를 유지하고 있기 때문에,이 모델은 잘 그들의 포상 분화의 일부 또는 전체 손실의 결과 많은 유전 변경을 표시 췌장 종양에서 설립 세포 라인과는 달리 체외에서 외분비 췌장의 생리를 공부에 적합합니다.
Introduction
외분비 췌장 조직 작업 연구 실험실 자주 발생하는 문제는 충분히 장기적인 실험을 할 수 있도록 일정 기간 동안 체외에서 포상 세포를 배양의 어려움이다.
이러한 문화 시스템의 개발을 방해 한 요인들은 췌장 세포의 분리 중에 출시 할 때 그대로 췌장 조직을 소화, 당분 단백질 분해하고 지방 분해 효소의 높은 콘텐츠로 인해 실험 조작에 췌장 조직의 고유 감도이다.
두 번째 인자가 분비 특성을 잃게하고 췌관 세포 나 간세포와 같은 세포 1. 등의 성숙한 세포로 transdifferentiate하는 경향이 포상 세포의 체외 소성의 놀라운 체외에서이 세포의 가소성은 실험 조건에 따라 달라집니다 (예 : 배지 조성 등 2) </>를 한모금 및 외분비 췌장 세포 1에 적합한 배양 조건의 디자인에 복잡성의 정도를 소개합니다.
여러 가지 방법이 처음 기니 돼지 췌장 3-5에서 포상 세포의 분리 및 배양을 위해 개발되었습니다. 처음에는 이러한 프로토콜은 활발한 기계적 분리에 의해 궁극적 격리와 콜라, 키모 트립신, 그리고 단백질 분해 효소 칵테일과 췌장 조직의 소화를하고있었습니다. 이런 식으로 고립 된 췌장 세포는 특히 비정상적인 구조 및 기능적 특성, 정점 구조와 자신의 막 수용체에 중요한 손상의 손실을 표시됩니다. 고립 된 세포는 1 개 또는 2 일 동안 가능한 남아 있었다.
의 준비 acini이 분비 6-8에 대한 응답으로 표면의 수용체에 손상을 제한하기 때문에 외분비 분비를 개선, 세포의 세포막을 유지, 자신의 내부 및 간 아키텍처를 유지하고 분산. 열매로그건,이 방법은 체외에서 7-10까지 일 포상 세포 생존 능력을 확장하는 중요한 이점을 제공합니다. 갭 접합에 의한 세포 커플 링 등 간 연락처, 유지 보수는 외분비 췌장 포상 세포의 표현형 13의 중요한 결정이기 때문에 또한,이 방법은 현재 9-12 포상 세포 분리하는 것이 바람직하다.
포상 세포와 유관 세포들이 분화의 탈분화 공격적인 외분비 췌장 암 (14)의 기원에 대해 제안 된 메커니즘 중 하나이기 때문에, 분산 acini 모델은 또한 췌장의 가소성과 그 이후의 분자 메커니즘을 연구하는 적절한 시스템입니다. 또한, 유전자 변형 동물 15,16의 사용과 유전자 전달 기술의 개발 (아데노 바이러스 2 렌티 바이러스 전달, 나노 입자 등의 사용)와 함께이 체외 기본 포상 세포 모델 수다양한 유전 적 장애는 포상 세포 분화 또는 탈분화의 규정에 영향을 미칠 췌장염의 발병, 전암 병변 세포 가소성의 변화에 대한 책임 분자 사건의 더 나은 이해를 제공하는 방법을 결정하는 데 매우 유용합니다.
분산 acini의 분리는 우리가 문화 췌장 포상 세포 연구실에서 사용하는 방법입니다. 우리는 여기에서 설명하고 사용 방법을 설명합니다. 그것은 포상 세포의 분리없이 기계적 중단에 결합 된 췌장 조직 (박테리아 콜라 포함)의 효소 해리을 포함한다. 대부분의 프로토콜이 정지 또는 특수 처리 플라스틱 기판에 하나 배양 acini를 포함하는 동안, 우리는 장기 세포 배양이 필요한 경우 매트릭스 비계에 나중에 그들을 뿌리기 만 간단히 (24 시간)을 정학을 성장.
이 프로토콜은 분산 췌장 교류의 신속한 분리 (이하 HR)에서 할 수 있습니다INI, 문화에 1 주일 이상 지속. 그것은 마우스의 췌장 당 20 × 10 6 포상 세포의 분리 할 수 있습니다. 단순는 가능한 독립적으로 병렬로 많은 10 췌장을 처리 할 수 있습니다. 현재 사용할 수있는 모든 다른 외분비 췌장 모델은 많은 유전 적 표시 췌장 종양에서 파생 된대로 acini의 내부 및 간 아키텍처와 이렇게 고립 된 일차 전지의 포상 표현형을 유지하여,이 모델은, 분화 메커니즘 연구를위한 선택의 시스템을 구성 변화는 세포의 변화를 선도.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 췌장 포상 세포를 분리하기위한 절차를 설명합니다. 이 방법은보다 1 시간에 동물 당 20 × 10 6 포상 세포를 분리 할 수 있습니다. 의 신속하고 간단한 구현 (많은 10 췌장은 독립적으로 병렬 실험 당 처리 할 수 있습니다) 덕분에,이 프로토콜은 기존의 분리 방법 3-5,9-12,17 사이 좋은 타협으로 나타납니다.
중요한 단계 / 트러블 슈팅…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 동물 보호와의 기술 지원을 AniCan의 직원 (CRCL, 리옹) 감사합니다. 이 작품은 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암으로, 문화원 국립 뒤 암에 의해, 그리고에서 장학금으로 문화원 국립 드 라 상테 엣 드 라 공들인 Médicale (INSERM Avenir에서 프로그램), 리그 국립 Contre 르 암에 의해 지원되었다 프랑스 Ministère 드 난 Enseignement 수피 리어 엣 드 라 공들인에서 문화원 국립 뒤 암 (JG), (RMP와 DFV)에서와 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암에서 리그 국립 Contre 르 암 (JG), ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
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