Summary
In dieser Veröffentlichung beschreiben wir eine schnelle und bequeme Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von primären Azinuszellen des Pankreas von dem murinen Bauchspeicheldrüse. Diese Methode stellt einen wertvollen Ansatz, um die Physiologie der frischen primären normal / transformierten exokrinen Pankreas-Zellen zu studieren.
Abstract
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Trennung (in weniger als 1 Stunde) von Maus Pankreasazini, so dass es möglich ist, sie in der Kultur für mehr als eine Woche halten. Mehr als 20 x 10 6 Azinuszellen aus einem einzigen murine Pankreas gewonnen werden. Dieses Protokoll bietet die Möglichkeit, unabhängig verarbeiten zu 10 Pankreas sind. Weil es acinar Architektur bewahrt, ist dieses Modell auch für das Studium der Physiologie des exokrinen Pankreas in vitro im Gegensatz zu Zelllinien aus Tumoren der Bauchspeicheldrüse, die viele genetische Veränderungen zu einer teilweisen oder vollständigen Verlust ihrer acinar Differenzierung angezeigt gegründet geeignet.
Introduction
Ein häufig auftretendes Problem für Forschungslabore auf exokrinen Pankreasgewebe ist die Schwierigkeit der Kultivierung Azinuszellen in vitro für einen bestimmten Zeitraum lang genug, um ein langfristiges Experiment erlauben.
Ein Faktor behindern Entwicklung solcher Systeme Kultur ist die intrinsische Empfindlichkeit von Pankreas-Gewebe experimentelle Manipulation durch den hohen Gehalt in glykolytischen, proteolytische und lipolytische Enzyme, die wörtlich verdauen Pankreasgewebe, wenn sie bei der Isolierung von pankreatischen Zellen freigesetzt werden.
Ein zweiter Faktor ist die bemerkenswerte in vitro Plastizität Azinuszellen, die ihre sekretorischen Eigenschaften verlieren und transdifferenzieren anderen reifen Zellen, wie Pankreasgangzellen oder Leber-ähnlichen Zellen 1. Neigen In vitro variiert diese Zellplastizität mit den experimentellen Bedingungen (z. B. Zusammensetzung des Kulturmediums) 2 1.
Mehrere Methoden zur Isolierung und Kultur der Azinuszellen, zuerst aus dem Meerschweinchen Bauchspeicheldrüse 3-5 entwickelt. Zunächst werden die Protokolle Verdauung von Pankreasgewebe mit Kollagenase, Chymotrypsin und einer Protease Cocktail beteiligt, mit ultimativen Isolierung durch kräftiges mechanische Dissoziation. Die Zellen der Bauchspeicheldrüse auf diese Weise isoliert angezeigt abnorme strukturelle und funktionelle Eigenschaften, insbesondere ein Verlust von apikalen Strukturen und erhebliche Schäden an ihrer Membran-Rezeptoren. Isolierte Zellen blieben nur für 1 oder 2 Tage lebensfähig.
Herstellung von dispergierten acini unterhält ihre intra-und interzellulären Architektur, die Erhaltung Zellmembranen, Schadensbegrenzung zu Oberflächen-Rezeptoren und damit die Verbesserung der exokrinen Sekretion in Reaktion auf Sekretagoga 6-8. Als result, bietet dieses Verfahren den großen Vorteil, sich Azinuszelltumoren Lebensfähigkeit zu 7-10 Tagen in vitro. Darüber hinaus ist dieses Verfahren derzeit Azinuszelltumoren Isolierung 9-12 da die Wartung der interzellulären Kontakte, darunter Zelle Kopplung durch Gap Junctions, ist eine wesentliche Determinante des exokrinen Pankreas Azinuszelltumoren Phänotyp 13 bevorzugt.
Da die Entdifferenzierung von Azinuszellen und ihre transdifferentiation zu duktalen Zellen ist einer der vorgeschlagenen Mechanismen für die Entstehung von aggressiven exokrinen Bauchspeicheldrüsenkrebs 14, ist die dispergierte acini Modell auch ein geeignetes System zur Pankreas-Plastizität und ihrer späteren molekularen Mechanismen zu studieren. Darüber hinaus in Kombination mit dem Einsatz von gentechnisch veränderten Tieren 15,16 und die Entwicklung von Gentransfer-Techniken (Adenovirus 2 oder lentiviralen Transduktion, Einsatz von Nanopartikeln, etc), diese in vitro primäre Azinuszelltumoren Modell kannsehr nützlich sein, zu bestimmen, wie verschiedene genetische Störungen der Regulierung der Azinuszelltumoren Differenzierung oder Entdifferenzierung beeinflussen und sollte ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge verantwortlich für das Auftreten von Pankreatitis, Krebsvorstufen und Veränderungen in Zellplastizität bieten.
Isolation von dispergierten acini ist der Ansatz, die wir in unserem Labor zu Kultur Azinuszellen des Pankreas. Wir beschreiben und diskutieren die Methode verwendet. Es handelt enzymatische Dissoziation von Pankreasgewebe (mit einer bakteriellen Collagenase) gekoppelt mechanisches Aufbrechen ohne Dissoziation Azinuszellen. Während die meisten Protokolle Kultivieren der Acini, beinhalten entweder in Suspension oder auf speziell behandeltem Kunststoff Substraten wachsen wir sie in Suspension nur kurz (24 Std.), Säen sie anschließend auf einer Matrix Gerüste, wenn längerer Zellkultur erforderlich.
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Trennung (in weniger als 1 Stunde) des Pankreas verteilt acini, nachhaltige für mehr als eine Woche in der Kultur. Es ermöglicht Isolierung von mehr als 20 x 10 6 Zellen pro Maus acinar Bauchspeicheldrüse. Die Einfachheit ist es möglich, unabhängig verarbeiten zu 10 Pankreas sind. Durch die Beibehaltung des intra-und interzellulären Architektur der Acini und damit die acinar Phänotyp der isolierten primären Zellen, stellt dieses Modell ein System der Wahl für die Untersuchung von Mechanismen transdifferentiation, wie alle anderen exokrinen derzeit verfügbaren Modelle von Tumoren der Bauchspeicheldrüse Anzeige von vielen genetischen abgeleitet Änderungen, die zu zellulärer Transformation.
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Protocol
Alle Verfahren wurden durch eine Ethikkommission unter regulatorischen der staatlichen Behörde genehmigt ("Comité d'Auswertung Commun Au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de Transit de l'ENS, au PBEs et au Laboratoire P4" (CECCAPP)). Die Mäuse wurden in einem spezifischen Pathogen-freien tierischen Anlage am "Plateforme AniCan, Centre Léon Bérard" (Lyon, Frankreich) gepflegt und behandelt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts.
Eine schematische Darstellung des Verfahren ist in Fig. 1 gezeigt.
1. Bauchspeicheldrüse Dissection und Kanalkrümmung (Tag 0)
Eine sehr schnelle Präparation ist für eine optimale Ausbeute der Extraktion und eine gute Lebensfähigkeit der Zellen in der Kultur gewährleisten. Um die Zeit für Pankreas Isolierung erforderlich zu reduzieren, müssen alle Hilfsmittel bereit, bevor der Maus Euthanasie.
- Euthanize Maus durch CO 2 Ersticken oder Genickbruch.
Von diesem Schritt müssen alle Verfahren unter einer sterilen Atmosphäre (MSW, Stufe II) mit steriler Dissektion Ausrüstung durchgeführt werden.
- Befestigen Sie die Maus und die Maus sprühen Bauch mit 70% Ethanol. Mit allen Sezieren Scheren und Zangen, einen V-förmigen Einschnitt an den Genitalbereich und fortsetzen bis die Membran vollständig zu öffnen Sie die Bauchhöhle.
- Positionieren Sie die Leberlappen gegen die Membran, sie sollten dort bleiben, wenn der Körperhöhle offen ist weit genug. Ziehen Sie den Darm und den Darm außerhalb der Bauchhöhle auf der linken Seite, und finden Sie das Rektum. Mit einem Paar und einer gebogenen Pinzette Präparierscheren, zupacken und Abschnitt das Rektum.
- Mit der gleichen Pinzette vorsichtig entrollen ganz den Darm aus dem Rektum in den Magen in den Darm, indem auf der linken Seite.
- Mit Noyes Schere und einer Pinzette vorsichtig schneiden die Bauchspeicheldrüse entlang des Darms und befreien sie mit der Milz von dem Rest des Verdauungstraktes.
- Besorgen Sie sich die Milz und die Bauchspeicheldrüse Abschnitt attached to it (Abbildung 2).
Bei diesem Schritt sicher sein, dass kein mesenterialen Fettgewebe und / oder andere benachbarte Gewebe (Milz, Darm usw.) mit der Bauchspeicheldrüse gesammelt werden, um zelluläre Kontamination zu vermeiden.
Für den Rest des Verfahrens sind alle Puffer ohne Kalziumionen Ca 2 + Chelatbildner hergestellt werden, um die vollständige Dissoziation des exokrinen Pankreasgewebe in einzelne Azinuszellen vermeiden.
- Spülen Sie die Bauchspeicheldrüse zweimal in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1x.
Bei diesem Schritt wird als Fettgewebe schweben entgegen Bauchspeicheldrüse, die sinken, ist es leicht möglich, zu visualisieren und schnell entfernen die Verunreinigung weißen Fettgewebe noch Bauchspeicheldrüse angebracht.
Wenn die Bauchspeicheldrüse muss auf die Zellkultur-Anlage transportiert werden, muss es auf dem Eis in HBSS 1x gehalten werden.
- Übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse in einer sterilen Petrischale mit 5 ml HBSS 1x. Mit Noyes Schere und Skalpell, schneiden die Bauchspeicheldrüse in kleine Stücke von 1 bis 3 mm 3 (3A).
2. Enzymatische und mechanische Dissociations der Bauchspeicheldrüse (Tag 0)
- Übertragen Sie sie in ein steriles 50 ml Polypropylen-Röhrchen.
- Zentrifuge für 2 min bei 450 xg und 4 ° C. Absaugen und den Überstand verwerfen, um Zelltrümmer und Blutzellen zu entfernen.
- 10 ml Kollagenase IA-Lösung (HBSS 1x mit 10 mM HEPES, 200 U / ml collagenase IA und 0,25 mg / ml Trypsin-Inhibitor) auf Pankreasschnitte. Mit einem 25 ml serologische Pipette, übertragen Sie sie auf einer 25 cm 2-Kolben. Inkubieren Sie für 20-30 min bei 37 ° C. Während dieser Zeit (alle 5 min), führen eine mechanische Dissoziation durch energetisch Bewegung hin-und her die Bauchspeicheldrüse Fragmente etwa zehnmal, in sterilen Pipetten von abnehmender Größe (25, 10 und 5 ml serologischen Pipetten).
Bei diesem Schritt ist es wichtig, häufig überwacht, inwieweit der enzymatischen Spaltung von Pankreasschnitten.
- Wenn das Gewebe der Bauchspeicheldrüse zu gut dissoziiert scheint (nach dem Verschwinden von Pankreas-Fragmente und der erhöhten Trübung der Lösung) (3B), stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 10 ml kaltem gepufferte Waschlösung (HBSS 1x mit 5 % Fetal Bovine Serum (FBS) und 10 mM HEPES).
- Übertragen in ein steriles 50 ml Polypropylen-Röhrchen und centrifuge für 2 min bei 450 xg und 4 ° C. Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen, um die Kollagenase IA Lösung zu entfernen.
- Resuspendieren und waschen das Pellet mit 10 ml gepufferte Waschlösung. Zentrifuge für 3 min bei 450 xg und 4 ° C. Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.
3. Filtration und Seeding von Dispersed Acini (Tag 0)
- Zellpellet in 7 ml Waymouth-Medium, das 2,5% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin-Gemisch (PS), 0,25 mg / ml Trypsin-Inhibitor und 25 ng / ml rekombinantem humanen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF).
- Filtrat die Zelle Mischung, indem man es durch ein 100 &mgr; m-Filter, um die nicht verdauten Fragmente (Kanäle, Blutgefäße und Langerhans-Inseln) behalten passieren. Bauchspeicheldrüsenkrebs acinar Strukturen (acinus von 10-15 Zellen) durchlaufen.
- Spülen Sie den Filter mit 6 ml Medium enthaltenden Waymouth der FBS, PS, Trypsin inhibitor und EGF.
Nach diesem Schritt müssen die Zellen sehr vorsichtig behandelt werden, um jede Acini Dissoziation zu vermeiden.
- Seed das isolierte acini in einer 6-Well Kulturschale (2 ml pro Well) (3C). Kultur sie bei 37 ° C unter 5% (v / v) CO 2 Atmosphäre.
Nach diesem Schritt werden die Azinuszellen in Suspension kultiviert.
4. Azinuszelltumoren Kultur (Tag 1 bis 10)
- Vierundzwanzig Stunden nach, übertragen Sie die Acini (in Suspension) in eine neue 6-well Kulturschale, um die Verunreinigung Zellen und zelluläre Reste, die über Nacht eingehalten haben (Abbildung 4) zu beseitigen.
Wenn die Zellkultur muss für mehrere Tage oder, wenn die experimentellen Bedingungen Zellen in Monolayer gewachsen erfordern, ist es um die Übertragung und Saatgut acini auf Matrix Gerüste empfohlen verlängert werden.
- Am Tag zuvor zu sehending auf Matrix-Unterstützung (Tag 0), Wappen eine 6-well Kulturschale mit Kollagen Typ I (5 ug / cm 2). 1 ml der Typ-I-Kollagen-Lösung (50 g / ml in 0,02 M Essigsäure, 0,2 um filtriert) in jede Vertiefung und lassen Sie es passiv adsorbieren auf Kunststoff, während 1 Stunde bei 37 ° C (oder über Nacht bei 4 ° C ).
- Saugen Sie die Typ-I-Kollagen-Lösung und spülen Sie die beschichteten Wells zweimal mit Phosphat-gepufferte Saline 1x.
- Lassen Sie das beschichtete gut trocknen (unter einer MSW) mindestens 12 Stunden vor dem Gebrauch.
- Übertragen der isolierten primären Acini (erhalten in Schritt 4.1) in der Typ-I-Collagen-beschichteten 6-Loch-Kulturplatte und Kultur sie in den gleichen Bedingungen wie zuvor beschrieben (bei 37 ° C unter 5% (v / v) CO 2-Atmosphäre) . Die Zellen des Typ I-Kollagen Substrat haften für 2 Tage.
- Am Tag 3, verändern das Kulturmedium zu nicht lebensfähigen Zellen, die nicht eingehalten wurden beseitigen. Mit der Zeit in Kultur werden die Zellen schrittweise spLesen auf das Kollagen-haltige Unterstützung. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage (Abbildung 5).
Die isolierten Azinuszellen erhalten kann gezählt werden, nach einer kompletten mechanischen Dissoziation durch Verwendung einer Zelle Thoma Zählkammer. Beachten Sie, dass isolierte Azinuszellen nicht in Kultur gehalten werden danach.
Die Qualität der acinar Kultur erhalten können, indem die Expression von acinar spezifische Marker wie Trypsinogen, Bauchspeicheldrüse Transcription Factor 1-Untereinheit Alpha oder Carboxypeptidase A1 (Immunzytochemie oder Immunfluoreszenz Experimente) gesteuert werden.
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Representative Results
Abbildung 1 schematisch die "verteilt" acini Methode zur primären Azinuszellen Isolation. Die entscheidenden Schritte, die streng im Protokoll eingehalten werden müssen, werden in der Diskussion Teil beschrieben.
Um die Entfernung zu erleichtern, hat die Bauchspeicheldrüse vom Abdomen zusammen mit der beigefügten Milz (2) gesammelt werden. Beide Organe müssen auseinander geschnitten werden, und das verbleibende Fettgewebe, die noch an der Bauchspeicheldrüse könnte angebracht werden müssen entfernt werden (Schritt 1.6) werden.
Die Makro-und mikroskopische Bilder, die in 3 gezeigt sind, stellen das Ergebnis nach jedem Schritt der enzymatischen und mechanischen Abweichungen der Bauchspeicheldrüse. Nach Aufschneiden, wird die Bauchspeicheldrüse in kleine Teile (; Step 1.8 3A) unterteilt. Die 3B zeigt den Aspekt der Bauchspeicheldrüse nach einer erfolgreichen enzymatische Dissoziation unter Berufung auf eine sorgfältige temporal Überwachung der laufenden Verdauung (Schritt 2.4). Dieser Schritt ist ein entscheidender Schritt, um die genaue Zeit, die benötigt wird, zu bestimmen. Die 3C zeigt das erhaltene Material nach der Filtration des Pankreas Mischung (Schritt 3.4). Nur die gut getrennten Acini sind nach diesem Schritt gehalten.
Die Abbildung 4 ist ein typischer Tag 1 Darstellung Pankreasazini isoliert mit unserem Protokoll. Die Übertragung von Azinuszellen in eine neue Kulturschale erlaubt, um die zellulären Fragmenten und die anhaftenden Verunreinigungen Zellen (Schritt 4.1) zu beseitigen.
Wie in Abbildung 5, wenn auf Kollagen Typ I kultiviert gezeigt, breitete die Azinuszellen und verlieren ihre acinar Differenzierung (Morphologie und 3D-Organisation), was zu einer Monoschicht aus spindelförmigen Zellen (Schritt 4.6).
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Protokolls ermöglicht die Isolierung von primären Maus verteilt Acini.
Abbildung 2. Gross Anatomie der Bauchspeicheldrüse nach der Sektion. Rote und gelbe Pfeile zeigen jeweils die restlichen anatomischen Verbindungen mit der Milz und mesenterialen Fettgewebe, die für Pankreas Sammlung geschnitten werden müssen.
Abbildung 3. Verstreute acini Isolierung (Tag 0) visualisiert durch makroskopische Beobachtung (links) und Phasen-Kontrast-Mikroskopie (rechts, 40-facher Vergrößerung). A) Nach Kanalkrümmung (dargestellt in einem 25 cm 2-Kolben). B) Nach Kollagenase IA Verdauung und kräftig mechanische dissociatiweiter. C) Nach der Filtration und Transfer in einer 6-Well Kulturschale.
Abbildung 4. Verstreute acini Kultur, 24 Stunden nach der Aussaat (Tag 1), visualisiert durch Phasenkontrast-Mikroskopie (40-facher Vergrößerung).
Abbildung 5. Verstreute acini Kultur an einem Typ-I-Kollagen-beschichtete Schale an den Tagen 2, 4, und 7 visualisiert Phasen-Kontrast-Mikroskopie (40X, 120X, 240X und Vergrößerungen).
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von pankreatischen Azinuszellen. Dieses Verfahren macht es möglich, mehr als 20 x 10 6 Zellen pro Tier acinar in weniger als 1 h zu isolieren. Dank seiner schnellen und einfachen Implementierung (so viele wie 10 Bauchspeicheldrüsen unabhängig pro Experiment parallel verarbeitet werden), wird dieses Protokoll als guter Kompromiss zwischen bestehenden Isolation Methoden 3-5,9-12,17.
Kritische Schritte / Fehlersuche
Die Effizienz dieser Methode beruht auf Vorsichtsmaßnahmen an einigen kritischen Punkten gemacht. Der erste Schritt der Bauchspeicheldrüse Kanalkrümmung (Schritt 1.8) ist wichtig, um nachfolgende Bauchspeicheldrüse enzymatische Verdauung. Unzureichende Zerteilen verringert die Ausbeute der enzymatischen Spaltung und die Anzahl der Azinuszellen erhalten. Dies macht es notwendig, Inkubation mit Kollagenase IA verlängern, zwangsläufig verursacht eine übermäßige Dissoziation der Azinuszellen und aufeinantiv zunehmende Zelltod.
Wie oben darauf hingewiesen, ist die zweite kritische Schritt der Verdauung durch Kollagenase IA (Schritt 2.3). Zuviel enzymatische Spaltung führt zu einer hohen Rate von Zelltod. Das Ausmaß der Bauchspeicheldrüse Verdauung müssen häufig in dieser kritischen Schritt (3B) überwacht werden. Nach der mechanischen und enzymatischen Dissoziation, muss besondere Aufmerksamkeit zu schenken, um sehr vorsichtig handhaben die dispergierte acini um ihre interzellulären Strukturen zu bewahren.
Einschränkungen
Selbst wenn die Zugabe von Epidermal Growth Factor (EGF), um die Waymouth Kultur ausfallen kann die progressive acinar zu duktalen transdifferentiation, ist es wichtig, die Zellen am Leben zu erhalten.
Wie im Protokoll beschrieben und, wenn nötig, die in vitro-Kultur, der Azinuszellen kann verlängert werden bis zu 10 Tage nach der Aussaat der Zellen auf Matrix scaffJährigen wie Typ-I-Kollagen. Noch wichtiger ist, und wie von anderen 1, das Kultivieren von Zellen auf Kollagen Typ I angezeigt, induzieren die progressive transdifferentiation von Azinuszellen zu duktalen Zellen. Dieser Prozess beginnt nach 4 Tagen Kultur auf Kollagen und kann nach 7 Tagen abgeschlossen. Es kann daher notwendig sein, um das Vorhandensein eines bestimmten ductal Marker wie die Cystische Fibrose Transmembran Regulator oder Cytokeratin-19 (Immunzytochemie oder Immunfluoreszenz Experimente) prüfen, ob die Azinuszelltumoren Kultur muss zu 1 Woche verlängert werden. Die alternative Verwendung von Matrigel als Matrix Gerüst durch das Anhaften der dispergierten Acini, macht es möglich, die Wartung der acinar Phänotyp für 2 Tage verlängern.
Mögliche Änderungen
Schneiden das Rektum während der Präparation Schritt erhöht das Risiko einer bakteriellen Kontamination. Wir haben noch nie eine solche situ erlebtation. Allerdings, wenn nötig, gibt es ein weiteres Verfahren, um dieses mögliche Problem zu umgehen. Es besteht aus der Suche nach der Magen, Milz und den ersten Teil des Duodenums und Schneiden beigefügten Bauchspeicheldrüse. Beachten Sie, dass diese alternative Verfahren, um perfekt beherrscht werden muss. Andernfalls wird die Dauer der Dissektion länger werden, gefährdet dann die Qualität des entnommenen biologischen Materials.
Die langfristige Monoschichtkultur Azinuszellen kann optimiert werden, insbesondere durch die Änderung der Support-Matrix. Wenn von den experimentellen Bedingungen erforderlich Kollagen Typ I mit einem anderen Gerüst wie Matrigel ersetzt werden kann. In diesem Fall muss Matrigel frisch bei 400 ug / ml Konzentration werden in kaltem vorbereitet Phosphate-Buffered Saline 1x. Danach werden Vertiefungen mit Matrigel (40 ug / cm 2) über Nacht bei 4 ° C inkubiert Dieser Punkt muss strikt eingehalten werden. Die Kulturführung bleibt die gleiche wie in Schritt 4 beschrieben.
Das Verfahren ca.n weiter optimiert werden empirisch. Zum Beispiel kann die Menge der Aminosäuren in dem Kulturmedium der exokrinen Pankreaszellen Proteinsynthese durch diese Zellen 18 zu regulieren. Sphyris et al. 2 und Blauer et al. 19 haben einen vollständigen Kulturmedium, enthaltend eine höhere Menge an Aminosäuren (essentielle und nicht-essentielle) erarbeitet, die Förderung der Aufrechterhaltung der Azinuszellen im differenzierten Zustand. Ein solches Medium kann sehr nützlich sein, wenn man wünscht, Kultur Azinuszellen durch dieses Verfahren für mehr als 10 Tage isoliert.
Ein weiterer Parameter, der geändert werden, wenn Langzeitkultur benötigt werden könnte, ist der pH-Wert des Kulturmediums. Physiologisch ist der apikale Pol Azinuszellen in ständigem Kontakt mit einem Bicarbonat-reichen, leicht alkalischen Flüssigkeit, die zu den Pankreas-Saft. Es ist verlockend zu spekulieren, dass der pH-Wert des Azinuszelltumoren Umwelt sein könnte bei der Aufrechterhaltung der acinar differentiatio wichtign Zustand. Einige Protokolle zuvor berichteten über die Verwendung eines Kulturmediums mit einem pH-Wert eingestellt auf 7,8, um den "initial" Physiologie Azinuszellen 19 zu imitieren.
Bedeutung der Technik
Es ist wichtig zu erwähnen, dass es existieren andere Protokolle für die Kultivierung Azinuszellen mit Pankreas Explantate und organotypische Kulturen 19. Ihre Anwendung ist auf Pankreas Zellmigration aus dem Explantat, um die Membran auf dem sie gezüchtet werden, beträgt erschwert. Isolation dieser Zellen der Bauchspeicheldrüse erfordert vor allem einen ersten Woche des Pankreas Explantatkultur. Der große Vorteil dieses Verfahrens ist, dass keine enzymatische Dissoziation benötigt wird, so dass sowohl die Integrität der Zellmembran und Zell-Zell-Wechselwirkungen erhalten bleiben. Unter diesen Bedingungen kann Azinuszellen in vitro für 14 Tage gehalten werden. Doch die Azinuszelltumoren Kultur erhalten ist nicht rein, und Verunreinigung Fibroblasten, ductal cEllen und Endothelzellen sind zwangsläufig vorhanden, die unvereinbar sein könnten mit einigen Arten von Experimenten. Im Gegensatz dazu liefert unser Verfahren schnell eine reine Population von Azinuszellen, Erhaltung ihrer ursprünglichen Architektur der Acini.
Dorrell et al. Beschrieben eine andere Methode, um die verschiedenen Zelltypen Maus Pankreas (einschließlich acinar-, Kanal-und endokrinen Zellen) zu isolieren, mit Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) 17. Diese Methode ist sehr effizient, um eine reine (oder spezifisch) Bevölkerung von Azinuszellen erhalten. Es erfordert jedoch eine fluoreszierende Markierung mit spezifischen Antikörpern, die frühere Sortierung. Darüber hinaus erfordert dieses Verfahren auch eine Expertise in FACS und einem Durchflusszytometer. Außerdem erfordert diese Technik nicht zulassen, eine verlängerte Kultur von Azinuszellen, durch den Verlust ihrer ursprünglichen Architektur Acini. Unsere schnelle Methode ermöglicht eine erweiterte In-vitro-Kultur von dispergierten Azinuszellen mit einer Qualität und Reinheit, dass einwieder kompatibel mit den meisten der weiteren Routine-Anwendungen.
Zukünftige Anwendungen
Sobald beherrschen, sollte diese Technik zur Isolierung / Kultivierung Azinuszellen als sehr nützlich erweisen bei der Bewältigung einer Reihe von Fragen und vor allem für die Untersuchung der Mechanismen in der Bauchspeicheldrüse Plastizität und transdifferentiation beteiligt, die gut bekannt sind, aber kaum verstanden. Durch die Erhaltung einige inter-und intrazelluläre Kommunikation, verteilt diese acini Modell bleibt mehr als physiologisch relevanten immortalisierten Zelllinien.
Auf dem Gebiet der Pankreas Tumorentstehung, bietet diese primären Zell-Modell ein angemessenes System für das Studium Azinuszelltumoren transdifferentiation, einer der Mechanismen vorgeschlagen, aggressive Bauchspeicheldrüsenkrebs zu generieren. Obwohl immortalisierten humanen oder murinen Zelllinien (wie Colo357, Panc-1 oder BxPC3) könnte flexibler sein, um als primäre Azinuszellen verwenden, sowohl ihren Ursprung und ihre Layoutlex genetischen Status (so transformierten Zelllinien ursprünglich aus Tumoren der Bauchspeicheldrüse oder Pankreas sogar Metastasen isoliert) stellen wesentliche Nachteile bei der Untersuchung solcher Mechanismen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken den Mitarbeitern der AniCan (CRCL, Lyon) für ihre technische Unterstützung bei der Tierpflege. Diese Arbeit wurde vom Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), die Ligue Nationale Contre le Cancer, von der Association pour la Recherche sur le Cancer, der vom Institut National du Cancer, und durch Stipendien unterstützt von der Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), aus dem Institut National du Cancer (JG), aus dem Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche in Frankreich (RMP und DFV) und der Vereinigung pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
- Lardon, J., Bouwens, L.
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
