Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells
Summary
I denne publikasjonen beskrives en hurtig og bekvem fremgangsmåte for isolering og dyrking av primære acinøse celler fra murin bukspyttkjertelen. Denne metoden utgjør en verdifull tilnærming for å studere fysiologi av friske primære normale / utransformerte eksokrine bukspyttkjertelen celler.
Abstract
Denne protokollen tillater hurtig isolering (i mindre enn 1 time) av murin pankreatisk acini, noe som gjør det mulig å opprettholde dem i kultur i mer enn en uke. Mer enn 20 x 10 6 akinærceller kan fås fra en enkelt murin bukspyttkjertel. Denne protokollen gir muligheten til selv å behandle så mange som 10 bukspyttkjertler parallelt. Fordi den bevarer acinar arkitektur, er denne modellen godt egnet til å studere fysiologi av eksokrin pankreas in vitro i motsetning til cellelinjer etablert fra svulster i bukspyttkjertelen, som viser mange genetiske forandringer som resulterer i delvis eller totalt tap av deres acinar differensiering.
Introduction
En hyppig oppstått problem for forskningslaboratorier som arbeider med eksokrin pankreatisk vev er vanskeligheten med å dyrke akinærceller in vitro hos et tidsrom lenge nok til å tillate et langtidsforsøk.
En faktor som hindrer utvikling av slike dyrkingssystemer er den iboende følsomheten av pankreatisk vev til eksperimentell manipulasjon på grunn av det høye innhold i glykolysen, proteolytisk og lipolytisk enzymer, som bokstavelig talt fordøye pankreasvevet når de er frigjort under isolering av pankreatiske celler.
En annen faktor er bemerkelsesverdig in vitro plastisitet av akinærceller, som har en tendens til å miste sine sekretoriske egenskaper og transdifferentiate til andre modne celler, for eksempel bukspyttkjertelen duktale celler eller hepatocyte-lignende celler en. In vitro, varierer denne cellen plastisitet med de eksperimentelle forhold (for eksempel kulturmediet sammensetning) 2 </sup> og introduserer en grad av kompleksitet i utformingen av hensiktsmessige kultur vilkår for eksokrine bukspyttkjertelen celler en.
Flere metoder er blitt utviklet for isolering og kulturen av akinærceller, først fra marsvin pankreas 3-5. I utgangspunktet disse protokollene involvert fordøyelsen av bukspyttkjertelen vev med collagenase, chymotrypsin, og en protease cocktail, med ultimate isolasjon av kraftig mekanisk dissosiasjon. Bukspyttkjertelen celler isolert på denne måten viste unormale strukturelle og funksjonelle egenskaper, særlig tap av apikale strukturer og betydelig skade på deres membranreseptorer. Isolerte celler forble levedyktige i bare en eller to dager.
Fremstilling av dispergert acini opprettholder deres intra-og intercellulær arkitektur, bevare cellemembraner, begrense skade på overflatereseptorer, og dermed forbedre eksokrin sekresjon i respons til secretagogues 6-8. Som et result, tilbyr denne metoden den store fordelen av å utvide acinar celleviabilitet til 7-10 dager in vitro. Videre er denne metoden for tiden foretrukket å acinar celleisolasjon 9-12 fordi vedlikehold av intercellulær kontakter, inkludert celle koblingen ved gap veikryss, er en viktig faktor for den eksokrin pankreas acinar cellefenotype 13.
Som dedifferentiation av akinærceller og deres transdifferentiation til ductal celler er en av de foreslåtte mekanismene for dannelsen av aggressive eksokrine pankreas cancer 14, er den dispergerte acini modellen også et tilfredsstillende system for å studere pankreatisk plastisitet og dets påfølgende molekylære mekanismer. Videre, i kombinasjon med bruken av genetisk modifiserte dyr 15,16 og utvikling av teknikker for genoverføring (adenoviral to eller lentiviral transduksjon, bruk av nanopartikler, etc), vil denne in vitro primære acinøs cellemodell kanvære svært nyttig for å bestemme hvordan ulike genetiske dysfunksjoner påvirke reguleringen av acinar celledifferensiering eller dedifferentiation og bør gi bedre forståelse av molekylære hendelsene ansvarlige for utbruddet av pankreatitt, forstadier til kreft, og endringer i celle plastisitet.
Isolering av dispergert acini er den tilnærmingen vi bruker i vårt laboratorium til kultur acinøse celler. Vi her beskriver og drøfter hvilken metode som brukes. Det innebærer enzymatisk dissosiasjon av pankreatisk vev (med en bakteriell kollagenase) koplet til mekanisk forstyrrelse uten dissosiering av akinærceller. Mens de fleste protokollene innebærer dyrking av acini, enten i suspensjon eller på spesialbehandlede plastunderlag, vokser vi dem i suspensjon bare en kort stund (24 timer), såing dem etterpå på matrix stillasene dersom forlenget cellekultur er nødvendig.
Denne protokollen tillater rask isolasjon (på mindre enn 1 time) av dispergert bukspyttkjertelen acini, bærekraftig for mer enn én uke i kultur. Det tillater isolering av mer enn 20 x 10 6 akinærceller pr mus bukspyttkjertel. Dens enkelhet gjør det mulig å bearbeide uavhengig av hverandre så mange som 10 bukspyttkjertler parallelt. Ved å opprettholde den intra-og intercellulært arkitektur acini og dermed acinar fenotype av isolerte primære celler, utgjør denne modellen et system av valget for studiet av transdifferentiation mekanismer, som alle andre eksokrine pankreas modeller tilgjengelig er avledet fra svulster i bukspyttkjertelen viser mange genetiske endringer som fører til cellulær transformasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en prosedyre for å isolere acinøse celler. Denne metoden gjør det mulig å isolere mer enn 20 x 10 6 akinærceller per dyr på mindre enn 1 time. Takket være sin raske og enkel implementering (så mange som 10 pancreases kan være uavhengig behandlet per eksperiment i parallell), vises denne protokollen som et godt kompromiss mellom eksisterende isolasjon metoder 3-5,9-12,17.
Kritiske trinn / feilsøking
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de ansatte i AniCan (CrCL, Lyon) for deres hjelp i forbindelse med dyr omsorg. Dette arbeidet ble støttet av Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale (INSERM Avenir Program), Ligue Nationale Contre le Cancer, av Association pour la Recherche sur le Cancer, ved Institut National du Cancer, og ved stipend fra Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), fra Institut National du Cancer (JG), fra Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche i Frankrike (RMP og DFV) og fra Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
