Проточной цитометрии анализа флуоресценции Бимолекулярные Комплементация обеспечивает высокую пропускную количественный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Эта методика может применяться для отображения сайтов связывания белков и скрининга факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.
Среди методов изучения белок-белковых взаимодействий внутри клеток, Бимолекулярные Комплементация флуоресценцию (BiFC) является относительно простым и чувствительным. BiFC основан на производство флуоресценции с использованием двух нефлуоресцентные фрагменты флуоресцентный белок (Венерой, желтый флуоресцентный вариант белка, используется здесь). Номера флуоресцентный Венера фрагментов (VN и VC) сливают с двух взаимодействующих белков (в данном случае, AKAP-Lbc и PDE4D3), что дает флуоресценции из-за VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 взаимодействие и формирование функциональный флуоресцентный белок внутри клеток.
BiFC предоставляет информацию о внутриклеточной локализации белковых комплексов и сила белковых взаимодействий на основе интенсивности флуоресценции. Тем не менее, BiFC анализа с использованием микроскопии для количественной оценки силы белок-белковых взаимодействий отнимает много времени и несколько субъективным из-за гетерогенности экспрессии белка и взаимодействия. Объединяя проточной цитометрииАнализ с методологией BiFC, BiFC флуоресцентный белок-белковое взаимодействие сигнал может быть точно измерена для большого количества клеток в течение короткого времени. Здесь мы демонстрируем применение этой методологии для сопоставления регионов PDE4D3, которые необходимы для взаимодействия с AKAP-Lbc. Эта высокая пропускная способность методика может быть применена к скрининг факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.
650 000 белок-белковых взаимодействий, по оценкам, существуют в человеческом интерактома, играющих важнейшую роль в поддержании нормальной функции клеток 1,2. Кроме того коиммунопреципитации (со-IP) золотым стандартом для изучения белок-белковых взаимодействий от клеточного лизата, несколько анализов фрагмент белка дополнения (СПС) были разработаны для повышения чувствительности для обнаружения белок-белковых взаимодействий внутри клеток 3. Методы включают Ферстер резонансный перенос энергии (лад), биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) и флуоресценции Бимолекулярные Комплементация (BiFC) 4,5. BiFC основана на облегченных объединение двух фрагментов флуоресцентный белок (здесь используется Венеры вариант YFP), которые каждый слитый с потенциальными партнерами взаимодействующих белков (в данном примере мы используем AKAP-Lbc и PDE4D3). Взаимодействие этих двух белков интерес внутри клеток приводит к функциональным флуоресценции, которые могут быть визуализированы еluorescence микроскопии с использованием прямой трансляции или в фиксированных клетках 6,7,8. По сравнению с другими СПС, BiFC чувствительны и менее технически сложных, с потенциалом для изучения клеточной локализации в живых клетках. Основным недостатком этого метода, однако, что как только образуется, флуоресцентный комплекс белок не может быть отменено. Поэтому это не является хорошим методом для изучения динамических белок-белкового взаимодействия. В данной работе мы используем BiFC для отображения взаимодействия сайтах PDE4D3 с AKAP-Lbc путем мониторинга интенсивности флуоресценции Венеры. По сравнению с традиционным анализом с помощью флуоресцентной микроскопии, которое является длительным и трудоемким (если не осуществляется с использованием автоматизированной машины высокой пропускной способностью), проточной цитометрии обеспечивает простой количественного анализа тысяч клеток в гетерогенную популяцию в течение короткого времени 9, 10. Здесь, путем проведения бок-о-бок сравнение проточной цитометрии-BiFC анализ и традиционных со-IP, мы показали, что две мethods представления сопоставимых данных, однако, проточной цитометрии BiFC анализ менее трудоемким и требует меньше материала, который может быть более полезным, когда клетки интерес ограничены.
BiFC является простой и чувствительный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Этот метод не может быть использован для идентификации новых белок-белковых взаимодействий, однако, это особенно удобно, чтобы подтвердить белок-белковых взаимодействий внутри клетки и изучать фу?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим O'Bryan лаборатории в МСЖД для критических экспериментальной оценки и обсуждения. Эта работа выполнена при поддержке Американской Ассоциации Сердца Грант 11SDG5230003 в ГКЦ и Национальный центр Продвижение Поступательное науки – МСЖД Центр клинических и трансляционных наук Грант UL1TR000050.
REAGENTS | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
EQUIPMENT | |||
CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |