دليل طريقة فعالة لإعداد Deboning سليمة ماوس النسيج الأنفي مع منظمة التشريحية المحفوظة
Abstract
الأنف الثدييات هو جهاز متعدد الوظائف مع الهياكل الداخلية المعقدة. واصطف تجويف الأنف مع مختلف ظهائر مثل ظهائر حاسة الشم والجهاز التنفسي، والحرشفية التي تختلف بشكل ملحوظ في المواقع التشريحية، مورفولوجيا، ووظائفها. في فئران بالغة، ويتم تغطية الأنف مع مختلف عظام الجمجمة، مما يحد من وصول التجريبية إلى الهياكل الداخلية، خصوصا تلك الموجودة في تلك الخلفية كما الظهارة الشمية الرئيسية (وزارة التربية). نحن هنا وصف وسيلة فعالة للحصول على ما يقرب من الأنسجة الأنفية كامل وسليمة مع منظمة التشريحية الحفاظ عليها. باستخدام أدوات جراحية تحت مجهر تشريح، ونحن بشكل تسلسلي إزالة عظام الجمجمة المحيطة الأنسجة الأنفية. يمكن تنفيذ هذا الإجراء على حد سواء، ورؤساء الماوس البشرة بارافورمالدهيد ثابتة وتشريح طازجة. الإجراء deboning كامل يستغرق حوالي 20-30 دقيقة، والذي هو أقصر بكثير من الوقت التجريبية اللازمة لدي التقليدية القائمة على المواد الكيميائيةتكلس. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم وسيلة سهلة لإزالة فقاعات الهواء المحبوس بين القرائن، وهو أمر حاسم للحصول على أجزاء متصلة أفقيا أو الاكليلية أو السهمي رقيقة من إعداد الأنسجة الأنفية. الأنسجة الأنفية إعدادها باستخدام طريقة لدينا يمكن استخدامها لمراقبة كامل جبل من ظهائر بأكمله، فضلا عن المورفولوجية، immunocytochemical، RNA التهجين في الموقع، والدراسات الفسيولوجية، وخاصة في الدراسات حيث منطقة محددة الفحص والمقارنة هي من الفائدة.
Introduction
تجويف الأنف الثدييات يحتوي على أنواع مختلفة من الأنسجة والأجهزة التي تخدم وظائف متميزة. تجويف الأنف تشكل جزء من دخول الجهاز التنفسي العلوي، والذي يسمح السفر الجوي من وإلى الرئتين. استنشاق الهواء يمر عبر تجويف الأنف حيث يخضع لدرجة الحرارة والرطوبة تكييف 1 وكذلك تنظيف أو تصفية لإزالة المواد المهيجة والسامة والكائنات الحية الدقيقة المعدية 2. يتم تنفيذ كل من العلاجات بها الأنف ظهائر والأنسجة تحت الظهارة، بما في ذلك الغدد والأوعية وحاسمة لحماية الشعب الهوائية السفلى والرئتين. بالإضافة إلى دورها في التنفس والدفاع الظهارية، يحتوي على أنسجة الأنف أيضا الأجهزة الحسية الطرفية للأنظمة حاسة الشم والعصب الثلاثي التوائم، الذي كشف عن مجموعة واسعة من المواد الكيميائية في الهواء يمر. اعتمادا على أي نظام يتم تنشيط والكشف الحسي للمواد الكيميائية في الأنف يمكن أن تثير إماوحاسة الشم، وتهيج، أو ألم 3،4.
نظام حاسة الشم الطرفية معقدة وتتكون من عدة مفصولة تشريحيا الحواس حاسة الشم داخل تجويف الأنف. فيما بينها، والظهارة الشمية الرئيسية (وزارة التربية) هو أكبر، والتي تشكل ما يقرب من 45-52٪ من ظهائر الأنف في القوارض (5) ويقع في المنطقة الخلفية. في المنطقة أمامي بطني، وهناك زوج من تركيبات أنبوبية المعروفة باسم الجهاز الميكعي 6، الذي يجلس على طول كل جانب من الحاجز الأنفي. مجموعتين إضافية صغيرة من الخلايا العصبية الحسية الشمية، والمعروفة باسم الجهاز الحاجز من ماسيرا 7،8 والعقدة Gruneberg 9، يقيمون على طول الحاجز البطني والمنطقة الظهرية من دخول تجويف الأنف، على التوالي. هذه الأجهزة الطرفية العصبية تحتوي على ظهائر مع السمات المميزة في التشكل والتعبير علامة الخلية، وظيفة فسيولوجية. معا أنها الكشف عن الآلاف من رائحةالجزيئات مع مجموعة رائعة وحساسية 10-12.
بالإضافة إلى الأجهزة الحسية الشمية، تجويف الأنف أيضا يضم أنظمة الحسية الأخرى. ومن المعروف أن ببتيدي المفعول الألياف العصبية مثلث التوائم موجودة في الظهارة الأنفية، وخصوصا ظهارة التنفسي 13،14. بعض من هذه الألياف كشف المواد الكيميائية المهيجة والسامة، وهي المسؤولة عن الشروع في ردود الافعال واقية مثل السعال والعطس 4،15. ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن مركبات معطر ومريرة مزعجة من قبل اكتشفت مؤخرا السكان من الخلايا حسي كيميائي الانفرادي (SCCS)، وكثير منها يتم معصب بواسطة الألياف العصبية مثلث التوائم 16-19. وتقع هذه SCCS في كثافة العالي في المنطقة من دخول تجويف الأنف والقنوات دخول الميكعي، ملمحا الى انه قد تخدم أيضا وظيفة وقائية 16-18. وبالتالي، يمكن أن الأنف ظهائر تختلف اختلافا جوهريا في وظيفة، مورفولوجيا، وتكوين الخلية اعتمادا على هممواقع التشريحية.
حتى داخل الظهارة واحدة والمتخصصة، وهناك اختلافات إقليمية. وزارة التربية والتعليم هو أحد الأمثلة على ذلك. خطوط زارة التربية والتعليم مختلف القرائن، التي هي معقدة وكرة لولبية الهياكل. بسببهم، مناطق مختلفة من تجربة وزارة التربية مختلف معدلات تدفق الهواء، وبالتالي، معدلات إزالة جزيئات رائحة المحمولة جوا 20 نشر مختلفة و. أيضا، فمن المعروف أن الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs) تعبر عن مستقبلات الرائحة نظرا تقع في واحدة من أربع مناطق التحايل من وزارة التربية 21،22. كيف يؤثر هذا الاختلاف الموقع استجابة لOSN لعطور وإلى حد كبير غير معروفة. وبالإضافة إلى ذلك، بعض السكان OSN يحمل تفضيل الإقليمية. OSNs غوانيليل محلقة-D (GC-D)، معربا عن ديها توزيعات منطقتين لصالح المناطق طريق مسدود دي الكيس من ectoturbinates 23،24. وفي الآونة الأخيرة، وجدنا جزء من السكان من OSNs الكنسي الذي يعبر عابر مستقبلات المحتملة قناة M5 (TRPM5) ويقع تفضيلي في المناطق الجانبية وبطني 25. هذه النتائج تشير إلى أن وزارة التربية ليست موحدة. ولكن، كيف تؤثر هذه الاختلافات الإقليمية الترميز حاسة الشم ليست مفهومة. هذا هو في جزء منه لأن التحقيق الفسيولوجية شامل من وزارة التربية والأنف كان محدودا بسبب صعوبة الحصول على حالها الأنف ظهائر مع منظمة التشريحية المحفوظة باستخدام الأساليب الحالية.
ويحيط الأنف ظهائر في الغالب من قبل العظام الأمامي من الجمجمة، بما في ذلك الأنف، الفك العلوي، الحنكي، الوجني، وعظام الغربالي. في فئران بالغة ونماذج القوارض الأخرى، هذه العظام هي شاقة وصعبة لإزالة دون الإضرار الأنسجة الأنفية مرتبطة ارتباطا وثيقا، ولا سيما القرائن دقيق. في كثير من الأحيان، يتم استخدام زوال الكلس القائمة على المواد الكيميائية لتليين العظام للسماح cryosectioning من الأنسجة الأنفية للالمورفولوجية، المناعى، والدراسات التهجين في الموقع، ولكن depenقرع على عمر الحيوان، ويمكن أن تستمر عملية إزالة الكلس بين عشية وضحاها يصل إلى 7 أيام 24،26-28. يتم هذا العلاج محدودة أيضا لأنه يتطلب أن تكون الأنسجة تثبيتي الحفاظ عليها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة الكلس الكيميائية أن تكون قاسية وتؤثر على الوسم المناعي من بعض الأجسام المضادة الحساسة 29،30. الدراسات الفسيولوجية، مطلوب الأنسجة الحية، وبالتالي، وكثيرا ما تجرى هذه التجارب في OSNs معزولة أو شرائح زارة التربية والتعليم التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة الذين هم رقيقة وناعمة 17،31،32 عظام الجمجمة. يمكن أيضا الاستفادة من الدراسات الفسيولوجية الاستعدادات جبل بأكمله عن طريق تقسيم رأس 25،33،34، ولكن عادة فقط على السطح الإنسي من الأنف يمكن الوصول إليه بسهولة، مما يحد من التسجيلات الفسيولوجية على مجالات أخرى.
هنا، نحن تصف، طريقة deboning دليل فعالة لإعداد الأنسجة الأنفية سليمة مع الحفاظ على منظمة التشريحية الأصلي والتشكل. نحن بالتسلسل إزالة العظام الرئيسية للالأماميوهناك حاجة الجمجمة تحت المجهر تشريح لفضح ظهارة الأنفية سليمة تماما تقريبا مع الحفاظ على العظام المحارة رقيقة سليمة إلا إذا كانت الفئران هي قديمة جدا وcryosectioning. ونعرب أيضا عن طريقة للحفاظ على العلاقة بين الأنسجة الأنفية وبصيلات الشم، فضلا عن بقية الدماغ، مما يسهل الفحص المتزامن للدوائر كلا الطرفية والمركزية. لدينا وسيلة يمكن استخدامها لإعداد بارافورمالدهيد ثابتة، وكذلك الطازجة، والأنسجة الأنفية الحية. وبالتالي، من المتوقع لدينا وسيلة لتسهيل الدراسات المورفولوجية، المناعى والفسيولوجية للتنفس، الشم، والأنف الضرر والمرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، أثبتنا إجراء خطوة بخطوة لعزل الأنسجة حاسة الشم والجهاز التنفسي سليمة من الأنف الماوس عن طريق إزالة بالتتابع العظام المحيطة في حين أن يجنب الأنسجة أدناه. وتبين لنا أن إزالة العظام دقيق يمكن الحفاظ حتى على الأنسجة الأكثر حساسية في مجملها. نحن أيضا نشارك نظرة ثاقب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة للبحوث (NIH / NIDCD 009269، 012831 والأذربيجانية الإدارية الملحق المنح NIH) إلى وى هونغ لين. نحن نخص بالشكر السيد تيم فورد في UMBC للحصول على المساعدة الفنية له في تصوير بالفيديو والتجهيز. ونود أيضا أن نشكر الدكتور دافني بلومبرغ، السيدة Chere تافه في UMBC والسيد نيكولاس ماكولوم من أوليمبوس أمريكا وشركة للحصول على مساعدة معداتهم في تصوير بالفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| [header] | |||
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [header] | |||
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. . Chemisthesis: The common chemical sense. , (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l’esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
