Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes
Summary
Xenoinjertos tumorales humanos en ratones inmunodeficientes son herramientas valiosas para el estudio de la biología del cáncer. Se describen los protocolos específicos para generar los xenoinjertos subcutáneos y intrahepática de células de carcinoma hepatocelular humano o fragmentos tumorales. La regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial en ratones receptores se presenta como una estrategia para facilitar el injerto intrahepática.
Abstract
En modelos experimentales in vivo de carcinoma hepatocelular (HCC) que recapitular la enfermedad humana proporcionan una valiosa plataforma para la investigación en la fisiopatología de la enfermedad y para la evaluación preclínica de nuevas terapias. Se presenta una variedad de métodos para generar subcutánea o ortotópico xenoinjertos de HCC humano en ratones inmunodeficientes que podría ser utilizado en una variedad de aplicaciones de investigación. Con un enfoque en el uso de tejido de tumor primario de pacientes sometidos a resección quirúrgica como punto de partida, se describe la preparación de suspensiones de células o fragmentos de tumor de xenoinjerto. Se describen técnicas específicas para estos tejidos xenoinjerto i) por vía subcutánea, o ii) intrahepatically, ya sea por implantación directa de células tumorales o fragmentos en el hígado, o indirectamente mediante la inyección de células en el bazo de ratón. También describimos el uso de la resección parcial del hígado de ratón nativo en el momento de xenoinjertos como una estrategia parainducir un estado de regeneración hepática activa en el ratón receptor que pueden facilitar el injerto intrahepática de las células tumorales humanas primarias. Los resultados esperados de estas técnicas se ilustran. Los protocolos descritos se han validado utilizando muestras y xenoinjertos humanos HCC primaria, que suelen realizar menos robusta que las líneas celulares de HCC humano bien establecidos que se utilizan ampliamente y frecuentemente citados en la literatura. En comparación con las líneas celulares, se discuten los factores que pueden contribuir a la relativamente baja probabilidad de injerto HCC primaria en modelos de xenotrasplante y hacer comentarios sobre cuestiones técnicas que pueden influir en la cinética de crecimiento de xenoinjertos. También le sugerimos los métodos que deben aplicarse para garantizar que los xenoinjertos obtenidos se asemejan con exactitud HCC tejidos padres.
Introduction
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más común en todo el mundo y el más rápido aumento de la causa de muerte por cáncer en Estados Unidos. El factor de riesgo más frecuente para el CHC es la cirrosis hepática, que ocurre con mayor frecuencia debido a la hepatitis crónica viral, el uso indebido de alcohol, enfermedades autoinmunes o trastornos metabólicos hereditarios 1.
A pesar de la pesada carga de enfermedades impuesta por HCC en las poblaciones de todo el mundo, la fisiopatología de la HCC es relativamente poco conocida en comparación con otros cánceres comunes como los colorrectales, de mama o cáncer de próstata. Por ejemplo, los eventos moleculares y celulares específicos tumorigénesis de conducción aún no se han definido claramente 2. Al igual que la mayoría de los otros cánceres epiteliales sólidos, los enfoques genómicos han revelado la heterogeneidad en las aberraciones asociadas con HCC 3. Un número de estudios han puesto de manifiesto la actividad desordenada de una variedad de vías de señalización implicadas en la proliferación celular, sursupervivencia, la diferenciación, y la angiogénesis 4. Además, el papel de las células madre de cáncer en el CHC patobiología Queda por aclarar 5.
Con una comprensión limitada de HCC fisiopatología, el arsenal de terapias efectivas para el CHC también ha permanecido relativamente limitada. Pacientes en etapa temprana con tumores confinados al hígado son candidatos para tratamiento curativo mediante la ablación del tumor o la resección quirúrgica, aunque la recurrencia es común. Para los pacientes con enfermedad más avanzada, la quimioterapia y la radiación son de eficacia limitada, y se utilizan principalmente para el control de la enfermedad con intención paliativa 6.
Alta calidad en modelos experimentales in vivo de HCC humano por lo tanto proporciona una valiosa plataforma para la investigación básica tan necesaria en la fisiopatología de HCC humano, así como para la evaluación de nuevos enfoques terapéuticos. En comparación con el uso de líneas celulares o modelos de ratón altamente definidos, xenoinjertos de PRImary tumores humanos en ratones inmunodeficientes han surgido como herramientas valiosas para tales estudios ya que son capaces de recapitular la enfermedad humana con alta fidelidad, mientras que también la captura de la heterogeneidad que está presente dentro y entre diferentes pacientes 7,8. Para este fin, hemos desarrollado una variedad de métodos para establecer xenoinjertos de HCC humanos en ratones inmunodeficientes. Mientras que la mayoría de los estudios publicados que implican xenoinjertos de HCC describen el uso de líneas celulares de HCC humano bien establecidos para este propósito, nos hemos centrado en la optimización de nuestros ensayos para generar los xenoinjertos a partir de muestras de HCC primarios obtenidos inmediatamente después de la resección quirúrgica de pacientes.
Diferentes técnicas de xenoinjertos pueden ser necesarios para diferentes aplicaciones de investigación. Por ejemplo, xenoinjertos subcutáneos generados a partir de fragmentos de tumor se generan rápidamente, se monitorizan fácilmente, y pueden ser más apropiadas para la administración local de nuevas terapias con convenienteseguimiento de la respuesta del tumor. Xenoinjertos intrahepáticos pueden ser más relevantes para los estudios relativos a la función del microambiente hepática en biología HCC. Los xenoinjertos generados a partir de suspensiones de células tumorales son necesarios para la identificación y caracterización de los subconjuntos de células iniciadoras del tumor o para experimentos que requieren en manipulaciones in vitro de células tumorales antes de los xenotrasplantes. Así, hemos desarrollado y validado los siguientes protocolos para establecer subcutánea o xenoinjertos intrahepáticas de las suspensiones de células o fragmentos tumorales derivadas de muestras de HCC humano primarios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito una variedad de técnicas para establecer subcutánea y intrahepáticos xenoinjertos de HCC humano en ratones inmunodeficientes que se pueden aplicar a una amplia variedad de preguntas experimentales y ensayos. Mientras xenoinjertos subcutáneos se han utilizado ampliamente para estudiar diversos aspectos de la biología de HCC, xenoinjertos intrahepáticos raramente se describen en la literatura. Además, la mayoría de los estudios que describen el uso de xenoinjertos han generado estos partir de línea…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta labor fue apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de la Fase 1 premio Clínico Scientist (AG) de y una subvención de funcionamiento de la Sociedad de Investigación del Cáncer (AG). Los autores agradecen al Dr. John Dick por su apoyo a este proyecto.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| LORIS 10% PVP-I Solution | LERNA Pharma Inc. | 109-09 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8″ taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100×20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1×2 teeth, 4-1/2″ | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4″ | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4″ | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2″ | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4″ | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2″ | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2″ | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B. Hepatocellular carcinoma. N. Engl. J. Med. 365, 1118-1127 (2011).
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma–a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal “capillarization” in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L. Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis. Hepatology. 56, 769-775 (1002).
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
