免疫不全マウスの皮下および肝内ヒト肝細胞癌異種移植片の生成
Summary
免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍の異種移植は、癌の生物学を研究するための貴重なツールです。ヒト肝細胞癌細胞または腫瘍断片の皮下および肝臓内異種移植片を生成するための特定のプロトコルが記載されている。レシピエントマウスにおいて、部分肝切除により誘発される肝臓再生は、肝移植を容易にするための戦略として提示される。
Abstract
生体内でヒトの疾患を再現肝細胞癌（HCC）の実験モデルは、疾患の病態生理の研究のためと新しい治療法の前臨床評価のための貴重なプラットフォームを提供します。我々は、研究の種々の用途に利用され得る免疫不全マウスの皮下または同所性ヒトHCC異種移植片を生成するために、種々の方法を提示する。出発点として外科的切除を受けた患者からの原発腫瘍組織の使用に焦点を当て、我々は異種移植用の細胞懸濁液または腫瘍断片の調製を記載する。マウス脾臓内またはii）肝臓内、いずれかの肝臓への腫瘍細胞または断片の直接注入によって、または間接的に細胞を注入することにより、我々は、これらの組織i）の皮下に異種移植するための特定の技術を記載している。我々はまた、戦略などの異種移植の時にネイティブのマウスの肝臓の部分切除の使用を記載初代ヒト腫瘍細胞の肝臓内移植を容易にすることができるレシピエントマウスにおける活性肝再生の状態を誘導する。これらの技術の期待される結果が示されている。記載されたプロトコルは、一般的に広く使用され、頻繁に文献に引用されている十分に確立されたヒト肝細胞癌細胞株よりも少ないロバスト行う一次ヒト肝細胞癌サンプルと異種移植片を使用して検証されています。細胞株と比較して、我々は、異種移植モデルにおいて原発HCC生着の比較的低い可能性に寄与し、異種移植片の増殖の動態に影響し得る技術的な問題についてコメントする要因を議論する。また、得られた異種移植片を正確に親HCC組織に似ていることを保証するために適用されるべき方法を示唆している。
Introduction
肝細胞癌（HCC）は、世界中の5番目に多いがんと北米における癌死の最も急速に増加原因となっています。 HCCのための最も優勢な危険因子は、最も頻繁に起因する慢性ウイルス性肝炎、アルコール乱用、自己免疫疾患、または遺伝性代謝障害1発生する、肝硬変である。
世界的な集団上HCCによって課される重い疾病負担にもかかわらず、HCCの病態生理は、比較的乏しい例えば、結腸直腸癌、乳癌、または前立腺癌のような他の一般的な癌と比較して理解される。例えば、腫瘍形成を駆動する特定の分子と細胞事象は明らかに2で定義されていない。他のほとんどの固体の上皮癌と同様に、ゲノムのアプローチは、HCC 3に関連する収差の不均一性を明らかにした。多くの研究は、シュール、細胞増殖に関与するシグナル伝達経路の種々の無秩序な活性を明らかにしたvival、分化、および血管新生4。また、肝細胞癌の病理生物学におけるがん幹細胞の役割は、5を明確にされていない。
HCCの病態生理の限られた理解した上で、肝細胞癌に有効な治療法の装備一式も比較的限定されたままである。再発は共通ですが、肝臓に限局した腫瘍を有する初期段階の患者は、腫瘍の切除や外科的切除を使用した根治療法の候補である。より進行した疾患を持つ患者のために、化学療法や放射線は、限られた有効性のものであり、緩和的意図を6と疾病管理のために主に使用されています。
人間のHCCの生体実験モデルにおいて 、高品質は、このように人間の肝細胞癌の病態生理学にだけでなく、新たな治療アプローチを評価するために多くの必要な基礎研究のための貴重なプラットフォームを提供します。細胞株または高度に規定されたマウスモデルを用い、PRIの異種移植片と比較して彼らはまた、7,8内および異なる患者との間に存在する不均一性を取り込む際に忠実に人間の病気をrecapitulatingすることができるので、免疫不全マウスでのメアリーのヒト腫瘍は、そのような研究のための貴重なツールとして浮上している。この目的のために、我々は、免疫不全マウスにおけるヒトHCC異種移植片を確立するための様々な方法を開発した。 HCC異種移植片を伴う公表された研究の大半は、この目的のために十分に確立されたヒトHCC細胞株の使用を記載しているが、我々はすぐに患者からの外科的切除後に得られた一次HCC標本から異種移植片を生成するために、我々のアッセイの最適化に焦点を当てている。
種々の異種移植技術は、異なる研究用途に必要とされてもよい。例えば、腫瘍断片から生成された皮下異種移植片が急速に発生し、容易に監視され、便利で新規な治療薬の局所投与のためのより適切かもしれない腫瘍反応のモニタリングが行われます。肝内異種移植は、肝細胞癌生物学の肝微小環境の役割に関する研究のためのより適切な場合があります。腫瘍細胞懸濁液から生成された異種移植片は、腫瘍開始細胞サブセットの同定および特徴付けのために、もしくは異種移植の前に、腫瘍細胞のインビトロ操作で必要とする実験のために必要である。我々は、このように開発され、初代ヒトのHCC検体から得られた細胞懸濁液または腫瘍断片から皮下または肝内異種移植片を確立するために、次のプロトコルを検証しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、実験的な質問および多種多様なアッセイに適用することができる免疫不全マウスに皮下および肝臓内のヒトHCC異種移植片を確立するために様々な技術を記載している。皮下異種移植片が広くHCC生物学の様々な側面を研究するために使用されてきたが、肝内異種移植片はほとんど文献に記載されていない。さらに、異種移植片の使用を記載した研究の大部分は、十分に確立された?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、健康の研究のフェーズ1臨床医科学者賞（AG）のカナダの協会および癌研究協会（AG）からの営業助成金によって支えられている。著者らは、このプロジェクトの彼のサポートのためのドクター·ジョン·ディックに感謝しています。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| LORIS 10% PVP-I Solution | LERNA Pharma Inc. | 109-09 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8″ taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100×20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1×2 teeth, 4-1/2″ | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4″ | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4″ | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2″ | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4″ | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2″ | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2″ | Almedic | A17-228 |
References
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