Generatie van subcutane en Intrahepatic Human Hepatocellular carcinoom Xenografts in immunodeficiënte muizen
Summary
Menselijke tumorxenotransplantaten in immunodeficiënte muizen zijn waardevolle instrumenten om kanker biologie studeren. Specifieke protocollen voor subcutane en intrahepatische xenograften uit menselijke hepatocellulair carcinoom cellen of tumorfragmenten genereren worden beschreven. Leverregeneratie geïnduceerd door gedeeltelijke hepatectomie in ontvangende muizen wordt gepresenteerd als een strategie om intrahepatische engraftment vergemakkelijken.
Abstract
In vivo experimentele modellen van hepatocellulair carcinoom (HCC) dat de menselijke ziekte recapituleren een waardevol platform voor onderzoek naar de ziekte van pathofysiologie en voor de preklinische evaluatie van nieuwe therapieën. We presenteren verschillende methoden voor subcutane of orthotopisch menselijke HCC xenograften in immuundeficiënte muizen die kunnen worden gebruikt in diverse onderzoekstoepassingen genereren. Met een focus op het gebruik van primaire tumorweefsel van patiënten die chirurgische resectie als uitgangspunt beschrijven we de bereiding van celsuspensies of tumorfragmenten voor xenografting. We beschrijven specifieke technieken om deze weefsels i) subcutane xenograft, of ii) intrahepatisch, hetzij door directe implantatie van tumorcellen of fragmenten in de lever, of indirect door injectie van de cellen in de muis milt. We hebben het gebruik van partiële resectie van de natieve muizenlever beschrijven ook bij de xenografting als strategie ominduceren een staat van actieve lever regeneratie in de ontvanger muis die de intrahepatische innesteling van primaire menselijke tumorcellen kan vergemakkelijken. De verwachte resultaten van deze technieken worden geïllustreerd. De beschreven protocollen zijn gevalideerd met primaire menselijke HCC monsters en xenografts, die typisch minder krachtig dan de gevestigde humane HCC cellijnen die verspreid zijn en vaak aangehaald in de literatuur voeren. In vergelijking met cellijnen, bespreken we de factoren die kunnen bijdragen tot de relatief lage kans op primaire HCC innesteling in xenotransplantatie modellen en commentaar op technische problemen die de kinetiek van xeno-groei kan beïnvloeden. We stellen ook voor methoden die moeten worden toegepast om ervoor te zorgen dat xenograften verkregen nauwkeurig lijken ouder HCC weefsels.
Introduction
Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de vijfde meest voorkomende kanker wereldwijd en de snelst toenemende oorzaak van overlijden door kanker in Noord-Amerika. De meest voorkomende risicofactor voor HCC is levercirrose, meest voorkomende door chronische virale hepatitis, alcoholmisbruik, auto-immuunziekte, of erfelijke metabole stoornissen 1.
Ondanks de zware lasten van ziekte HCC op populaties wereldwijd, is de pathofysiologie van HCC relatief slecht begrepen in vergelijking met andere gemeenschappelijke kanker, zoals colorectale, borst-of prostaatkanker. Bijvoorbeeld, specifieke moleculaire en cellulaire gebeurtenissen rijden tumorigenesis blijven duidelijk worden omschreven 2. Net als de meeste andere vaste epitheliale tumoren, hebben genomische benaderingen geopenbaard heterogeniteit in de afwijkingen in verband met HCC 3. Een aantal studies verstoorde activiteit van een verscheidenheid van signalerende wegen betrokken bij celproliferatie, sur geopenbaardVival, differentiatie, en angiogenese 4. Bovendien is de rol van kanker stamcellen in HCC pathobiology nog worden opgehelderd 5.
Met een beperkt begrip van HCC pathofysiologie, heeft het arsenaal van effectieve therapieën voor HCC ook relatief beperkt gebleven. Vroeg stadium patiënten met tumoren beperkt tot de lever zijn kandidaten voor curatieve therapie met tumor ablatie of chirurgische resectie, maar herhaling is gemeenschappelijk. Bij patiënten met gevorderde ziekte, chemotherapie en straling van beperkte werkzaamheid en worden voornamelijk gebruikt voor ziektebestrijding palliatieve intentie 6.
Hoge kwaliteit in vivo experimentele modellen van menselijke HCC bieden dus een waardevol platform voor veelgevraagde basisonderzoek naar de pathofysiologie van menselijke HCC en voor evaluatie van nieuwe therapeutische benaderingen. Vergeleken met het gebruik van cellijnen of zeer gedefinieerde muismodellen, xenografts van primary menselijke tumoren in immunodeficiënte muizen hebben ontpopt als waardevolle instrumenten voor dergelijke studies, omdat ze in staat zijn recapituleren de menselijke ziekte met hoge getrouwheid, terwijl ook het vastleggen van de heterogeniteit die aanwezig binnen en tussen verschillende patiënten 7,8 is zijn. Daartoe hebben we verschillende methoden menselijke HCC xenograften vaststellen immunodeficiënte muizen ontwikkelden. Terwijl de meerderheid van de gepubliceerde studies met HCC xenograften beschrijven het gebruik van gevestigde menselijke HCC cellijnen voor dit doel, hebben we ons gericht op het optimaliseren van onze analyses te xenograften uit primaire HCC specimens verkregen onmiddellijk na chirurgische resectie van patiënten te genereren.
Verschillende xenografting technieken kan nodig zijn voor verschillende wetenschappelijke toepassingen. Bijvoorbeeld, subcutane xenotransplantaten gegenereerd tumorfragmenten snel tot zijn gemakkelijk gevolgd, en meer geschikt voor plaatselijke toediening van nieuwe geneesmiddelen met handigmonitoring van de tumor respons. Intrahepatische xenotransplantaten belangrijker zijn voor studies met betrekking tot de rol van de lever micromilieu in HCC biologie. Xenotransplantaten gegenereerd uit tumorcellen suspensies nodig zijn voor de identificatie en karakterisatie van tumor-initiërende cel subsets of experimenten die in vitro manipulatie van tumorcellen voorafgaand aan xenotransplantatie. We hebben dus ontwikkeld en gevalideerd de volgende protocollen om subcutaan of intrahepatische xenograften vestigen van celsuspensies of tumor fragmenten afkomstig uit primaire menselijke HCC exemplaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben verschillende technieken beschreven subcutane en intrahepatische menselijke HCC xenograften vaststellen immunodeficiënte muizen die kan worden toegepast op een grote verscheidenheid van experimentele vragen en assays. Terwijl subcutane xenotransplantaten zijn op grote schaal gebruikt om verschillende aspecten van HCC studie biologie worden intrahepatische xenotransplantaten zelden in de literatuur beschreven. Verder is de meeste studies die het gebruik van xenotransplantaten zijn gegenereerd uit deze gevestig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Canadese Institutes of Health Research Fase 1 Werker-Scientist Award (AG) en een exploitatiesubsidie van de Research Society Cancer (AG). De auteurs zijn dank aan dr. John Dick voor zijn ondersteuning van dit project.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| LORIS 10% PVP-I Solution | LERNA Pharma Inc. | 109-09 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8″ taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100×20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1×2 teeth, 4-1/2″ | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4″ | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4″ | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2″ | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4″ | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2″ | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2″ | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B. Hepatocellular carcinoma. N. Engl. J. Med. 365, 1118-1127 (2011).
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma–a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal “capillarization” in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L. Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis. Hepatology. 56, 769-775 (1002).
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
