Menneskelige tumorxenotransplantater i immunodeficient mus er verdifulle verktøy for å studere kreft biologi. Spesifikke protokoller for å generere subkutane og intrahepatiske xenografts fra humane leverkreft celler eller tumor fragmenter er beskrevet. Leveren regenerering indusert ved delvis hepatectomy i mottaker mus er presentert som en strategi for å lette intrahepatisk engraftment.
In vivo eksperimentelle modeller av leverkreft (HCC) som rekapitulere den menneskelige sykdommen gi en verdifull plattform for forskning på sykdom patofysiologi og for preklinisk vurdering av nye behandlingsformer. Vi presenterer en rekke metoder for å generere subkutan eller ortotopiske human HCC xenografts in immunodeficient mus som kan benyttes i en rekke forskningsapplikasjoner. Med et fokus på bruk av primærtumor vev fra pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon som utgangspunkt, vi beskrive utarbeidelsen av cellesuspensjoner eller svulst fragmenter for xenografting. Vi beskriver spesifikke teknikker for å xenograft disse vev i) subkutant, eller ii) intrahepatically, enten ved direkte implantering av tumorceller eller fragmenter inn i leveren, eller indirekte ved injeksjon av celler i musemilt. Vi beskriver også bruk av delvis reseksjon av den opprinnelige muselever ved xenografting som en strategi for åindusere en tilstand av aktiv lever regenerering i mottakeren mus som kan lette intrahepatisk engraftment av primære humane tumorceller. De forventede resultatene av disse teknikkene er illustrert. Protokollene er beskrevet er godkjent for bruk primære menneskelige HCC prøver og xenografts, som vanligvis utfører mindre robust enn de veletablerte menneskelig HCC cellelinjer som er mye brukt og ofte sitert i litteraturen. I sammenligning med cellelinjer, diskuterer vi faktorer som kan bidra til relativt lav sjanse for primær HCC engraftment i xenotransplantasjon modeller og kommentere på tekniske problemer som kan påvirke kinetikken av xenograft vekst. Vi foreslår også metoder som å sikre at xenografts innhentet nøyaktig ligne foreldre HCC vev skal brukes.
Leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreftformen på verdensbasis, og den raskest økende årsaken til kreftdød i Nord-Amerika. Den mest utbredte risikofaktor for HCC er skrumplever, hyppigst forekommende på grunn av kronisk viral hepatitt, alkoholmisbruk, autoimmun sykdom, eller arvelige metabolske forstyrrelser en.
Til tross for den tunge sykdomsbelastningen pålagt av HCC på populasjoner over hele verden, er patofysiologien for HCC relativt dårlig forstått i forhold til andre vanlige kreftformer slik som kolorektal, bryst, eller prostatakreft. For eksempel, bestemte molekylære og cellulære hendelser kjøre tumorigenesis gjenstår å være klart definert to. Som de fleste andre faste epitelial kreft, har genomisk tilnærminger avslørt heterogenitet i de avvik forbundet med HCC tre. En rekke studier har vist uordnede aktiviteten av et utvalg av signalveier som er involvert i celle-proliferasjon, survival, differensiering, og angiogenese fire. I tillegg rollen som kreft stamceller i HCC patobiologi ennå ikke klarlagt 5.
Med en begrenset forståelse av HCC patofysiologi, har armamentarium av effektive behandlingsformer for HCC også holdt seg relativt begrenset. Tidlig stadium pasienter med svulster begrenset til leveren er kandidater for kurativ behandling ved hjelp av svulst ablasjon eller kirurgisk fjerning, men tilbakefall er vanlig. For pasienter med mer avansert sykdom, cellegift og stråling er av begrenset effekt, og brukes primært for sykdomskontroll med palliativ hensikt seks.
Høy kvalitet in vivo forsøksmodeller av human HCC gir således en verdifull plattform for mye nødvendig grunnforskning i patofysiologien for human HCC samt for evaluering av nye terapeutiske tilnærminger. Som sammenlignet med bruk av cellelinjer eller høyt definerte musemodeller, xenografter av primary menneskelige svulster i immundefekte mus har dukket opp som verdifulle verktøy for slike studier siden de er i stand til å rekapitulere den menneskelige sykdom med high fidelity og samtidig ta den heterogeniteten som er til stede i og mellom ulike pasienter 7,8. For å oppnå dette, har vi utviklet en rekke metoder for å etablere menneskelige HCC xenografts i immunsvikt mus. Mens de fleste publiserte studier med HCC xenografts beskrive bruk av veletablerte menneskelig HCC cellelinjer for dette formålet, har vi fokusert på å optimalisere våre analyser for å generere xenografts fra primær HCC prøver hentet umiddelbart etter kirurgisk reseksjon fra pasienter.
Ulike xenografting teknikker kan være nødvendig for ulike forskningssøknader. For eksempel er subkutane xenografts generert fra tumor fragmenter generert raskt, er lett overvåkes, og kan være mer hensiktsmessig for lokal forvaltning av romanen legemiddel med praktiskovervåking av tumorrespons. Intrahepatic xenografts kan være mer relevant for studier knyttet til rollen som den levermikromiljøet i HCC biologi. Xenografts generert fra tumorcellesuspensjoner er nødvendig for identifikasjon og karakterisering av tumor-celle undergrupper initiering eller for eksperimenter som krever in vitro manipuleringer av tumorceller før xenotransplantasjon. Vi har derfor utviklet og validert følgende protokoller for å etablere subkutan eller intrahepatic xenografts fra cellesuspensjoner eller svulst fragmenter avledet fra primær menneskelig HCC prøver.
Vi har beskrevet en rekke teknikker for å etablere subkutan og intrahepatiske human HCC xenografts in immunodeficient mus som kan anvendes på et bredt spekter av eksperimentelle spørsmål og-analyser. Mens subkutane xenografts har blitt mye brukt for å studere forskjellige aspekter av HCC biologi, er intrahepatiske xenografts sjelden er beskrevet i litteraturen. Videre har de fleste studier som beskriver bruken av xenografter ble generert fra disse etablerte cellelinjer. Gitt begrensningene i kreftcellelinjer i mode…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en kanadiske Institutes of Health Research Fase 1 Lege-Scientist Award (AG) og en driftsstøtte fra Cancer Research Society (AG). Forfatterne er takknemlige til Dr. John Dick for sin støtte til dette prosjektet.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
LORIS 10% PVP-I Solution | LERNA Pharma Inc. | 109-09 | |
Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
#5-0 Soft silk surgical suture, 3/8″ taper point needle | Syneture | VS-880 | |
Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
Petridish sterile 100×20 mm | Sarstedt | 821474 | |
Tissue forcep, 1×2 teeth, 4-1/2″ | Almedic | A10-302 | |
Adson dressing forcep 4-3/4″ | Almedic | A10-220 | |
Eye dressing forcep, serrated, straight, 4″ | Almedic | A19-560 | |
Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2″ | Almedic | A12-142 | |
Iris scissor, curved, 4-1/4″ | Almedic | A8-690 | |
Iris scissor, straight, 4-1/2″ | Almedic | A8-684 | |
Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2″ | Almedic | A17-228 |