Generering av Subkutan og Intrahepatisk menneskeleverkreft xenografts i immunodeficient Mus

Summary

Menneskelige tumorxenotransplantater i immunodeficient mus er verdifulle verktøy for å studere kreft biologi. Spesifikke protokoller for å generere subkutane og intrahepatiske xenografts fra humane leverkreft celler eller tumor fragmenter er beskrevet. Leveren regenerering indusert ved delvis hepatectomy i mottaker mus er presentert som en strategi for å lette intrahepatisk engraftment.

Abstract

In vivo eksperimentelle modeller av leverkreft (HCC) som rekapitulere den menneskelige sykdommen gi en verdifull plattform for forskning på sykdom patofysiologi og for preklinisk vurdering av nye behandlingsformer. Vi presenterer en rekke metoder for å generere subkutan eller ortotopiske human HCC xenografts in immunodeficient mus som kan benyttes i en rekke forskningsapplikasjoner. Med et fokus på bruk av primærtumor vev fra pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon som utgangspunkt, vi beskrive utarbeidelsen av cellesuspensjoner eller svulst fragmenter for xenografting. Vi beskriver spesifikke teknikker for å xenograft disse vev i) subkutant, eller ii) intrahepatically, enten ved direkte implantering av tumorceller eller fragmenter inn i leveren, eller indirekte ved injeksjon av celler i musemilt. Vi beskriver også bruk av delvis reseksjon av den opprinnelige muselever ved xenografting som en strategi for åindusere en tilstand av aktiv lever regenerering i mottakeren mus som kan lette intrahepatisk engraftment av primære humane tumorceller. De forventede resultatene av disse teknikkene er illustrert. Protokollene er beskrevet er godkjent for bruk primære menneskelige HCC prøver og xenografts, som vanligvis utfører mindre robust enn de veletablerte menneskelig HCC cellelinjer som er mye brukt og ofte sitert i litteraturen. I sammenligning med cellelinjer, diskuterer vi faktorer som kan bidra til relativt lav sjanse for primær HCC engraftment i xenotransplantasjon modeller og kommentere på tekniske problemer som kan påvirke kinetikken av xenograft vekst. Vi foreslår også metoder som å sikre at xenografts innhentet nøyaktig ligne foreldre HCC vev skal brukes.

Introduction

Leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreftformen på verdensbasis, og den raskest økende årsaken til kreftdød i Nord-Amerika. Den mest utbredte risikofaktor for HCC er skrumplever, hyppigst forekommende på grunn av kronisk viral hepatitt, alkoholmisbruk, autoimmun sykdom, eller arvelige metabolske forstyrrelser ^en.

Til tross for den tunge sykdomsbelastningen pålagt av HCC på populasjoner over hele verden, er patofysiologien for HCC relativt dårlig forstått i forhold til andre vanlige kreftformer slik som kolorektal, bryst, eller prostatakreft. For eksempel, bestemte molekylære og cellulære hendelser kjøre tumorigenesis gjenstår å være klart definert ^to. Som de fleste andre faste epitelial kreft, har genomisk tilnærminger avslørt heterogenitet i de avvik forbundet med HCC ^tre. En rekke studier har vist uordnede aktiviteten av et utvalg av signalveier som er involvert i celle-proliferasjon, survival, differensiering, og angiogenese ^fire. I tillegg rollen som kreft stamceller i HCC patobiologi ennå ikke klarlagt ^5.

Med en begrenset forståelse av HCC patofysiologi, har armamentarium av effektive behandlingsformer for HCC også holdt seg relativt begrenset. Tidlig stadium pasienter med svulster begrenset til leveren er kandidater for kurativ behandling ved hjelp av svulst ablasjon eller kirurgisk fjerning, men tilbakefall er vanlig. For pasienter med mer avansert sykdom, cellegift og stråling er av begrenset effekt, og brukes primært for sykdomskontroll med palliativ hensikt ^seks.

Høy kvalitet in vivo forsøksmodeller av human HCC gir således en verdifull plattform for mye nødvendig grunnforskning i patofysiologien for human HCC samt for evaluering av nye terapeutiske tilnærminger. Som sammenlignet med bruk av cellelinjer eller høyt definerte musemodeller, xenografter av primary menneskelige svulster i immundefekte mus har dukket opp som verdifulle verktøy for slike studier siden de er i stand til å rekapitulere den menneskelige sykdom med high fidelity og samtidig ta den heterogeniteten som er til stede i og mellom ulike pasienter ^7,8. For å oppnå dette, har vi utviklet en rekke metoder for å etablere menneskelige HCC xenografts i immunsvikt mus. Mens de fleste publiserte studier med HCC xenografts beskrive bruk av veletablerte menneskelig HCC cellelinjer for dette formålet, har vi fokusert på å optimalisere våre analyser for å generere xenografts fra primær HCC prøver hentet umiddelbart etter kirurgisk reseksjon fra pasienter.

Ulike xenografting teknikker kan være nødvendig for ulike forskningssøknader. For eksempel er subkutane xenografts generert fra tumor fragmenter generert raskt, er lett overvåkes, og kan være mer hensiktsmessig for lokal forvaltning av romanen legemiddel med praktiskovervåking av tumorrespons. Intrahepatic xenografts kan være mer relevant for studier knyttet til rollen som den levermikromiljøet i HCC biologi. Xenografts generert fra tumorcellesuspensjoner er nødvendig for identifikasjon og karakterisering av tumor-celle undergrupper initiering eller for eksperimenter som krever in vitro manipuleringer av tumorceller før xenotransplantasjon. Vi har derfor utviklet og validert følgende protokoller for å etablere subkutan eller intrahepatic xenografts fra cellesuspensjoner eller svulst fragmenter avledet fra primær menneskelig HCC prøver.

Protocol

En skjematisk oversikt over den protokoll er presentert i figur 1.. En. Processing of Human HCC Samples Skaffe primære menneskelige HCC prøvene med skriftlig pasientsamtykke og med godkjenning av den institusjonelle forskningsetisk bord. Disse protokollene har blitt utført ved vår institusjon med godkjenning fra University Health Network forskningsetikk Board i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for men…

Representative Results

Figur 3 viser det typiske utseende av en subkutan human HCC xenograft og den tilsvarende histopatologisk utseende av tumoren. Utvikling og vekst av subkutane xenografts lett kan overvåkes ved daglig undersøkelse av mottaker mus. Tidsintervallet mellom xenografting og utvikling av en tumor, kan variere sterkt avhengig av typen vev (tumor-fragment sammenlignet med cellesuspensjonen), en kilde for vev (primær pasientprøve, passaged xenotransplantat, eller cellelinje), og mengden av vev implanteres ( an…

Discussion

Vi har beskrevet en rekke teknikker for å etablere subkutan og intrahepatiske human HCC xenografts in immunodeficient mus som kan anvendes på et bredt spekter av eksperimentelle spørsmål og-analyser. Mens subkutane xenografts har blitt mye brukt for å studere forskjellige aspekter av HCC biologi, er intrahepatiske xenografts sjelden er beskrevet i litteraturen. Videre har de fleste studier som beskriver bruken av xenografter ble generert fra disse etablerte cellelinjer. Gitt begrensningene i kreftcellelinjer i mode…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12)	WISENT Bioproducts	319-075-CL
Collagenase TypeIV	Sigma-Aldrich	C5138
Dispase II	Stemcell Technologies	7923
Matrigel Matrix	Becton-Dickinson Biosciences	354234
10 % Buffered Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128
0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile	House Brand	1011-L8001
Betadine surgical scrub	Purdue Pharma	NPN 00158313
LORIS 10% PVP-I Solution	LERNA Pharma Inc.	109-09
Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	M60302
Tear-Gel	Novartis Pharmaceuticals
Frozen section compound	VWR	95057-838
Cryomold, Tissue -Tek	Sakura Finetek	4566
Precision Glide Needle 18G 1 ½	Becton-Dickinson Biosciences	305196
Precision Glide Needle 27G ½	Becton-Dickinson Biosciences	305109
Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½	Becton-Dickinson Biosciences	309301
Surgical blade No.10	Feather Safety Razor Co.	08-916-5A
#5-0 Soft silk surgical suture, 3/8″ taper point needle	Syneture	VS-880
Transpore surgical tape	3M Health care	1577-1
Cotton applicator	Medpro	018-425
Surgicel, oxidized regenerated cellulose	Ethicon	1951
Cell strainer 100 μm nylon	Becton-Dickinson Biosciences	352360
Magnification lighting with mobile base	Benson medical Industries Inc.	model: RLM-CLT-120V
Petridish sterile 100×20 mm	Sarstedt	821474
Tissue forcep, 1×2 teeth, 4-1/2″	Almedic	A10-302
Adson dressing forcep 4-3/4″	Almedic	A10-220
Eye dressing forcep, serrated, straight, 4″	Almedic	A19-560
Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2″	Almedic	A12-142
Iris scissor, curved, 4-1/4″	Almedic	A8-690
Iris scissor, straight, 4-1/2″	Almedic	A8-684
Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2″	Almedic	A17-228