Desorption elektrospray massespektrometri (DESI-MS) er en omgivende metode, som prøver, herunder biologiske væv, kan afbildes med minimal prøveforberedelse. Ved rastering prøven under ionisering sonden, giver denne spray-baseret teknik tilstrækkelig rumlig opløsning til at skelne molekylære egenskaber af interesse inden vævssnit.
Massespektrometri imaging (MSI) indeholder ikke-målrettet molekylær information med den højeste specificitet og rumlig opløsning til at undersøge biologisk væv ved hundredvis til snesevis af mikron skalaen. Når de udføres under omgivelsesbetingelser, prøve forbehandling bliver unødvendige, hvilket forenkler protokollen, samtidig med at den høje kvalitet af de indhentede oplysninger. Desorption elektrosprayionisering (DESI) er en spray-baseret omgivende MSI teknik, der giver mulighed for direkte prøvetagning af overflader i den åbne luft, selv in vivo. Når det bruges med en software-kontrolleret prøve fase prøven bitmapobjekt under DESI ionisering sonde, og gennem tidsdomænet er m / z information korreleret med kemiske arter 'rumlige fordeling. Nøjagtigheden af DESI-MSI udgang afhænger af kilden orientering og positionering i forhold til prøvens overflade og massespektrometer indløb. Heri gennemgår vi, hvordan man forbereder vævssnit for DESI imaging og yderligere eksperimentelle betingelser, der direkte påvirker billedkvaliteten. Konkret beskriver vi protokollen for billedbehandling af rotte hjernevæv sektioner ved DESI-MSI.
Målrettede imaging ved massespektrometri letter erhvervelsen af kemiske oplysninger for opdagelse og hypotese-genererende applikationer. Målrettet billeddannelse af en kendt kemisk interesse, på den anden side, kan fremme øget følsomhed og selektivitet gennem specifik metode udvikling. Massespektrometri imaging (MSI) er mest almindeligt udføres på væv ved hjælp af MALDI, 1 sekundær ion massespektrometri (SIMS), 2 og omgivende ionisering teknikker, herunder desorption elektrosprayionisering (DESI), 3 laserablation-elektrosprayionisering (LAESI), 4, 5 og flydende mikro-junction-overfladen prøvetagningssonde (LMJ-SSP). 6. MALDI og SIMS, prøverne skal fjernes fysisk fra prøven, og skal være flad og tynd, da de analyseres under højvakuum. MALDI kræver coating af prøven med en stråling-absorberende matrix, tilføje en ekstra og besværligt skridt til prøven forberedelse. SIMShar den højeste lateral opløsning, men bombardement med meget energirige partikler forårsager omfattende molekylære fragmentering. Derfor MSI ved omgivende metoder udfylde en niche, hvor blødt analyse med minimal prøveforberedelse er ønskelig. Men til dato er alle metoder stadig begrænset af kravet om flade prøve overflader.
DESI anvender en pneumatisk assisteret opkrævet opløsningsmiddel spray rettet mod prøveoverfladen at desorbere og ionisere analytter. 7 arbejdsmodel til desorption og efterfølgende ionisering ved DESI er kendt som "dråben pick-up-model". 8-10 De ladede primære dråber produceret af DESI sonde kolliderer med overfladen, fugtning det og danner en tynd film, i hvilken analysanden opløses ved en faststof-væske mikroekstraktion mekanismen 8 Efterfølgende dråbe kollisioner resulterer i momentum overførsel og start af sekundære dråber indeholdende det ekstraherede materiale fra overfladen . 9,10 sidste ende, gasfase ioner menes at blive produceret gennem ESI-lignende processer efter ion fordampning, charge restkoncentrationer modeller eller andre modeller, 11 dog den præcise iondannelse proces i DESI er endnu ikke eksperimentelt bevist. 12. DESI følsomhed er stærkt afhængig af opløseligheden af analytten i spray opløsningsmiddel som desorption afhængig af lokaliserede mikroekstraktion. 13.
Når det bruges med en software-kontrolleret prøve fase prøven scannes ensrettet med lane stepping under DESI ionisering sonde, og gennem tidsdomænet er m / z information korreleret med kemiske arter af geografisk fordeling (figur 1). Siden den første proof of principle DESI-MSI eksperiment rapporteret af Van Berkel og Kertesz i 2006, er 14 den teknik modnet betragteligt, 15 med rapporterede programmer i lipidanalyser, 3,16 narkotika metabolitter, 17,18 diseaSE biomarkører, 19 hjernevæv, 3,18,20 lungevæv, 18 nyrevæv, 18 testis væv, 18 binyrerne, 17 tyndtlagschromatografi plader, 21 og alger overflader. 22. Den rutinemæssige opløsning af billeder, opnået ved DESI-MSI er 100-200 um, hvilket i sidste ende bestemmes af det effektive overfladeareal ekstraheret med spray, men beslutninger så lavt som 40 um er blevet rapporteret. 23-25 sådan opløsning og nem analyse gør DESI-MSI passende til hurtig og simpel analyse af biologiske vævsprøver med arealer i 0,5-5 cm 2 rækkevidde, der muliggør erhvervelse af værdifulde geografisk information til bedre at forstå biologiske processer 26.. Her, som et eksempel på en typisk DESI-MSI program gennemgår vi de proceduremæssige detaljer at gennemføre et vellykket eksperiment involverer billeddannelse af lipider i rottehjernevæv. De to mest kritiske trin i protokollen ervævspræparatet 27 og DESI ionkilde optimering, som beskrevet nedenfor.
Optimering af DESI kilde geometri er afgørende for en vellykket MSI eksperimenter. De mange variabler der bidrager til tilpasningen af systemet direkte påvirker følsomheden og billedopløsning. Hvis der under optimering, forsøgslederen har vanskeligheder ved at få signal, anbefaler vi at bruge rød Sharpie spot trukket på diaset som et benchmark, farvestoffet, rhodamin 6G, m / z 443, producerer et stærkt signal i den positive ion-mode og kan bruges til indledende optimering. Derudover valg af opløsningsmid…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde understøttes af ARRA NSF MRI Instrument Development tilskud # 0923179 til FMF. Vi takker Aqua Asberry, Lab koordinator for Parker H. Petit Institut for bioteknologi og Biosciences Histology Core, for at få hjælp med vævssektionering.
Reagents | |||
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura-Finetek | 4583 | http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48 |
Acetonitrile | EMD | AX0156-6 | OmniSolv, LC-MS Grade |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092-500 ml | |
Equipment | |||
Cryostat microtome | Thermo Scientific | CryoStar* NX70 | Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar |
Omni Spray;DESI Spray Head | Prosolia Inc. | Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php | |
High Voltage Power Supply | Stanford Research Systems, Inc. | PS350/5000V-25W | http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm |
Rope heater, RTD, controller | Omega | http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters | |
Labview | National Instruments | Version 7.1 | |
Translational stage | Prior Scientific | Optiscan II | http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html |
AccuTOF Mass Spectrometer | JEOL | JMS-T100LC | Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface |