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Bioengineering

Imagerie des tissus biologiques par désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse

Published: July 12, 2013
doi:
10.3791/50575
, ,
1School of Chemistry and Biochemistry,Georgia Institute of Technology

Summary

Désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse (DESI-MS) est une méthode ambiant par lequel des échantillons, y compris les tissus biologiques, peuvent être imagées avec une préparation minimale de l'échantillon. Par rastering l'échantillon en dessous de la sonde d'ionisation, cette technique spray à base offre une résolution spatiale suffisante pour discerner les caractéristiques moléculaires d'intérêt au sein des coupes de tissus.

Abstract

L'imagerie par spectrométrie de masse (MSI) fournit de l'information moléculaire non ciblées avec la plus grande spécificité et la résolution spatiale pour l'étude des tissus biologiques à des centaines à des dizaines d'échelle microns. Quand elle est réalisée dans les conditions ambiantes, l'échantillon de pré-traitement devient inutile, ce qui simplifie le protocole tout en maintenant la haute qualité des renseignements obtenus. La désorption ionisation électrospray (DESI) est une technique de MSI ambiante à base de pulvérisation que permet l'échantillonnage direct de surfaces à l'air libre, même in vivo. Lorsqu'il est utilisé avec un étage d'échantillon commandé par logiciel, l'échantillon est tramé en dessous de la sonde d'ionisation DESI, et à travers le domaine du temps, m / z information est corrélée avec la répartition spatiale de l'espèce chimique. La fidélité de la sortie DESI-MSI dépend de l'orientation de la source et de positionnement par rapport à la surface de l'échantillon et d'une entrée de spectromètre de masse. Ici, nous examinons la façon de préparer des coupes de tissus pour DESI iforgemagie et conditions expérimentales supplémentaires qui influent directement sur la qualité de l'image. Plus précisément, nous décrivons le protocole pour l'imagerie des coupes de tissus de cerveau de rat par DESI-MSI.

Introduction

Imagerie non ciblée par spectrométrie de masse facilite l'acquisition de l'information chimique pour des applications de découverte et génératrice d'hypothèses. Imagerie ciblée d'un produit chimique connu sous le nom de l'intérêt, d'autre part, peut faciliter l'augmentation de la sensibilité et de sélectivité par le développement de la méthode spécifique. Spectrométrie de masse d'imagerie (MSI) est le plus souvent réalisée sur les tissus en utilisant MALDI, 1 spectrométrie de masse d'ions secondaires (SIMS), 2 et techniques d'ionisation ambiantes, y compris désorption ionisation électrospray (DESI), 3 ionisation laser ablation électrospray (LAESI), 4, 5 et liquide micro-jonction de la surface sonde de prélèvement (LMJ-SSP). 6 Dans MALDI et SIMS, les échantillons doivent être éliminés physiquement de l'échantillon, et doivent être plate et mince, comme elles sont analysées sous un vide poussé. MALDI nécessite revêtement de l'échantillon avec une matrice d'absorption de rayonnement, l'ajout d'une étape supplémentaire et encombrant pour la préparation de l'échantillon. SIMSa la résolution latérale la plus élevée, mais bombardement avec des particules de haute énergie provoque une fragmentation moléculaire. Par conséquent, MSI par des méthodes ambiantes occuper un créneau où l'analyse doux avec une préparation minimale de l'échantillon est souhaitable. Cependant, à ce jour, toutes les méthodes sont encore limités par l'exigence de surfaces d'échantillons plats.

DESI utilise un spray solvant chargé ASSISTEE dirigé à la surface de l'échantillon pour désorber et ioniser les analytes. 7 Le modèle de travail pour la désorption et l'ionisation ultérieure par DESI est connue comme la "goutte modèle pick-up". 8-10 Les gouttelettes chargées primaires produite par la sonde de DESI entrer en collision avec la surface, le mouillant et en formant un film mince dans laquelle la substance à analyser est dissous par un mécanisme de micro-extraction solide-liquide 8 ultérieur gouttelette collisions se traduisent par transfert de quantité de mouvement et de décollage de gouttelettes secondaires contenant la matière extraite de la surface 9,10. Finalement, le gazions en phase sont soupçonnés d'être générées par des processus ESI-comme la suite de l'évaporation de l'ion, modèles de résidus de charge ou d'autres modèles, 11 mais le processus de formation des ions précis dans DESI doit encore être prouvé expérimentalement. 12 sensibilité de DESI est fortement dépendante de la solubilité l'analyte dans le solvant de pulvérisation, que la désorption se fonde sur la micro-extraction localisée 13.

Lorsqu'il est utilisé avec un stade de l'échantillon contrôlé par logiciel, l'échantillon est analysé unidirectionnelle avec voie marcher sous la sonde d'ionisation de DESI, et à travers le domaine temporel, m / z information est corrélée avec la distribution spatiale de l'espèce chimique (figure 1). Depuis la première preuve de principe expérience DESI-MSI rapporté par Van Berkel et Kertesz en 2006, 14 la technique a considérablement évolué, avec 15 applications signalées dans l'analyse des lipides, 3,16 métabolites de drogues, 17,18 diseabiomarqueurs soi, 19 tissus du cerveau, 3,18,20 tissus du poumon, 18 tissu rénal, 18 tissu testiculaire, 18 glandes surrénales, 17 plaques de chromatographie sur couche mince, 21 et surfaces d'algues. 22 La résolution de routine des images obtenues par DESI-MSI est 100-200 um, ce qui est finalement déterminé par la surface effective extraite par les embruns, mais résolutions aussi basses que 40 um ont été rapportés. telle résolution et la facilité d'analyse 23-25 ​​rend DESI-MSI approprié pour l'analyse rapide et simple des échantillons de tissus biologiques avec des zones de surface dans la gamme 0,5-5 cm 2, ce qui permet l'acquisition de données spatiales utiles pour mieux comprendre les processus biologiques 26. Voici, à titre d'exemple d'application typique DESI-MSI, nous passons en revue les détails de la procédure de réalisation d'une expérience réussie impliquant l'imagerie de lipides dans les tissus du cerveau de rat. Les deux étapes les plus critiques dans le protocole sont lestissus préparation 27 et l'optimisation de la source d'ions de DESI, comme décrit ci-dessous.

Protocol

1. Tissue sectionnement Magasin, tout le tissu surgelé en -80 ° C congélateur jusqu'au moment de la coupe. Permettre à l'échantillon de tissu pour atteindre la température dans la cryomicrotome avant la coupe (30 min). Régler la lame et la température de l'échantillon à -30 ° C. Une fois que le tissu a atteint la température, la manipulation de l'échantillon avec des pincettes, couper avant ou l'arrière du cerveau en fonction de quelle partie du cerveau es…

Representative Results

La figure 3 montre un spectre représentant obtenu à partir d'une section de cerveau de rat non traité. Dans le mode positif, le spectre de masse est dominé par les phosphatidylcholines en raison de leur efficacité d'ionisation élevé (attribué au groupe d'ammonium quaternaire chargé positivement). L'image d'ions total de la coupe de tissu est également représenté sur la figure 3, montrant signaux abondante à travers toute la section du cerveau. Lipides cl…

Discussion

L'optimisation de la géométrie de la source de DESI est essentiel pour les expériences de MSI succès. Les multiples variables contribuant à l'alignement du système affectent directement la sensibilité et la résolution d'image. Si lors de l'optimisation, l'expérimentateur a des difficultés à obtenir signaux, nous vous recommandons d'utiliser lieu de Sharpie rouge dessiné sur la diapositive comme point de repère, la teinture, la rhodamine 6G, m / z 443, produit un signal fort dans le m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par l'ARRA NSF IRM Instrument Development Grant # 0923179 de FMF. Nous remercions Aqua Asberry, coordonnateur de laboratoire pour le H. Petit Institut Parker pour bioingénierie et Biosciences histologie de base, à l'aide de coupes de tissus.

Materials

Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray;DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface
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References

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Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).
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