Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre
Summary
Iki renkli floresan mikroskop için çift kamera emisyon bölme sistemleri olağanüstü optik ve zamansal çözünürlük, paralel plaka akış odası yapışma deneyleri dahil olmak üzere bazı canlı hücre deneyleri bir şartı ile gerçek-zamanlı görüntü dizileri oluşturmak. Yazılım aynı anda kazanılmış emisyon kanalları görüntüleri birleştirmek için kullanıldığı zaman, yalancı görüntü dizileri üretilir.
Abstract
Hücre zarında özel molekülleri tespit etmek için çok renkli, immünofloresan mikroskopi, dinamik akış koşulları altında hücre yapışması ilişkin mekanizmalar incelemektir paralel plaka akış odası deneyleri ile akuple edilebilir. Örneğin, birden fazla florofor ile işaretlenmiş kanser hücrelerinin, kanser metastazının mekanizmaları modellemek için bir potansiyel olarak reaktif alt-tabaka üzerinde perfüze edilebilir. Ancak, gerçek zamanlı canlı hücre analizi için görüntü edinimi çok kanallı tek kamera sistemleri ve renkli kameralar sergi eksiklikleri. Bu sınırlamaları aşmak için, biz aynı anda akış odasına floresan işaretli hücrelerin gerçek zamanlı görüntü dizileri yakalamak için bir çift kamera emisyon bölme sistemi kullanılır. Çift kamera emisyon bölme sistemleri filtre tanımlı dalgaboyu böylece aynı anda iki mekansal özdeş ama flüoroforla özel görüntüleri yakalayan iki monokrom CCD kamera, içine değişmektedir. Daha sonra, psuedocolored tek kanallı görüntüler tek bir birleştirilirGerçek-zamanlı hücreler ilgi bölgede hızla hareket eden birden fazla hedef moleküllerin ortaya çıkarabilir dizisi birleşti.
Introduction
Gibi immun boyama gibi hücre yüzeyi üzerinde moleküllerinin analizi için yöntemler, kimyasal olarak hedef moleküllerin saptanmasına olanak tanıyan, florofor konjuge edilir probları kullanır. Canlı hücre görüntüleme ve hidrodinamik akış tabanlı hücre yapışma deneyleri, tipik olarak, hücre ve / veya moleküler seviyede, 1, 2 fizyolojik süreçleri yakalamak için tasarlanmış tek renkli CCD kamera ile kaydedilir. Bu kameralar hızlı çerçeve oranları (saniyede 30'dan fazla kare) teslim ve (nedeniyle hızlı çerçeve oranları ve kısa pozlama süreleri için) istisnai zamansal çözünürlük sağlayan, son derece duyarlıdır. Ancak, tek renkli kameralar, sadece görüntü toplamak için (bir tek flüorofor tespit) tek bir emisyon kanalı yakalayabilir. Tek kamera emisyon bölme sistemleri birden fazla emisyon kanalları yakalamak için kurulmuştur ama genellikle görüş alanını azaltmak ve tüm kanalları görüntüleme için aynı pozlama süresini gerektirirler. Multip ile etiketlenmiş hücrelerin tam renk spektrumu yakalamak içinle renkli bir kamera, bir alternatif olarak kullanılabilir, flüoroforlar. Bununla birlikte, renk Kameralar bazı uygulamalarda canlı hücre görüntüleme için arzu zamansal çözünürlüğü sağlama genellikle yeteneğine sahip değildir. Başka bir görüntüleme düzeni yüksek bir zamansal çözünürlüğü korurken, birden fazla dalga boyunda görüntü canlı hücre avantajlı olduğu uygulamalar için gereklidir. Bir ilk uygulama deneysel hücreleri, potansiyel olarak reaktif alt-tabaka 1, 3 den fazla fizyolojik olarak uygun koşullarda perfüze edildiği paralel plaka akış odası yapışma deneyi, bir. Spesifik hücre yüzey molekülleri ifade akışta hücreler uygun ve bu yapışma molekülleri ya da yüzey-adsorbe hücre dışı matris proteinleri 4, 5 eksprese eden bir hücre tek tabaka olarak alt-tabaka üzerinde rulo olabilir. Rolling hücreler saliseler içinde dönme ve öteleme hareketini tabi olabilir. Haddeleme ve bu hücre yüzeyi moleküllerinin kümeleri olarak yapışık hücreler, Moleküler özellikler, aynı zamanda var potentidiğerleri, hücre yüzeyinde aktif bir yeniden geçmesi. Böylece, görüntüleme sistemleri istisnai bir zamansal çözünürlük sağlamak zorundadır (ikinci veya daha yüksek başına 30 kare ve pozlama süreleri "sıfıra yakın") hücre 6, 7 haddeleme adım adım ilerlemesini gösteren bir görüntü dizisi oluşturmak için. Çift kamera emisyon bölme sistemleri birden fluorophores etiketli görüntüleme hücreleri için bu talepleri karşılama yeteneğine sahiptirler.
Çift kamera emisyon bölme sistemleri, görüş tam saha korurken aynı anda iki mekansal özdeş ama flüoroforla özel görüntüleri yakalamak için iki benzer kameralar içine filtre floresan kanal bölünmüş ve. Bu teknoloji her kanalda gerçek zamanlı olarak çekilen görüntünün doğrudan karşılaştırılmasını sağlayan ve kullanıcı hızlı bir şekilde farklı görüntüleme yetenekleri ile kamera modelleri arasında geçiş yapmanızı sağlar. Bu özellik, daha iyi sistem yakalamak için izin bir kamera görüntü yakalama ayarları için ayarlamalar yapmak için yararlıdırFarklı yoğunluklarda, yaşamlar, ve sönme katsayıları 8 flüoroforlar. Görüntüleme yazılımı ile birleştiğinde, çift kamera emisyon bölme sistemleri, çoklu dalga boyları canlı hücre görüntüleme testlerinin gerçek-zamanlı kayıt izin ve hücre davranışlarını incelemek için floresan kullanmak in vitro deneyleri artırabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çift kamera emisyon bölme sistemi, hücre veya moleküler hareketin hızlı olduğu uygulamalarda yüksek kalitede görüntü yakalamak için gerekli mekansal zamansal ve optik çözünürlüğe sahip. Temsili sonuçlar üreten, yazılım ayarları ve kamera ayarları dahil çift kamera emisyon bölme sistemi, parametreler, haddeleme ve yapışan hücreler mekansal ve zamansal olarak hizalanmış olduğu bir birleştirilmiş görüntü dizisini elde etmek için optimize edilmiştir. Hiza hem yeşil ve kırmızı kanal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar anlayışlı tartışmalar ve el yazması inceleme için Dr Douglas Goetz (Bölümü Kimya ve Biyomoleküler Mühendisliği, Ohio Üniversitesi) ve Dr Fabian Benencia (Biyomedikal Bilimler Bölümü, Ohio Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Biz de yardımcı teknik tartışmalar (W. Nuhsbaum A.Ş.) Dr Christopher Huppenbauer teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık Ulusal Bilim Vakfı (CBET-1.106.118) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R15CA161830-01) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix |
References
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).
- Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).
- Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).
- Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
- Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).
- Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?. Front. Oncol. 2, 103 (2012).
- Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
- Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).
- Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).
- Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
- Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
- Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).
