Isolering af Primære myofibroblasts fra mus og Human tyktarmsvæv
Summary
Den myofibroblastlignende er en indflydelsesrig stromacellen af mave-tarmkanalen, der regulerer vigtige fysiologiske processer i både normale og sygdomstilstande. Vi beskriver en teknik, der giver mulighed for isolering af primære myofibroblasts fra både mus og human colon væv, som kan anvendes til in vitro-eksperimenter.
Abstract
Den myofibroblastlignende er en stromal celle i den gastrointestinale (GI) kanal, der har vundet betydelig opmærksomhed for sin afgørende rolle i mange GI funktioner. Mens flere myofibroblastlignende cellelinjer er kommercielt tilgængelige til at studere disse celler in vitro, forskningsresultater fra en cellelinje udsættes for eksperimentel cellekultur betingelser har iboende begrænsninger på grund af den alt for reduktionistisk arbejdets art. Anvendelse af primære myofibroblasts giver en stor fordel i form af bekræftelse eksperimentelle resultater identificeret i en cellelinie. Isolering af primære myofibroblasts fra en dyremodel giver mulighed for undersøgelse af myofibroblaster under betingelser, som i højere grad efterligner den sygdomstilstand, der undersøges. Isolering af primære myofibroblasts fra human colon væv giver velsagtens de mest relevante eksperimentelle data, da cellerne kommer direkte fra patienter med den underliggende sygdom. Vi beskriver en veletableret teknik, som kan være utilized at isolere primære myofibroblasts fra både mus og human colon væv. Disse isolerede celler er blevet karakteriseret for at være alpha-glatmuskel-actin og vimentin-positive, og desmin-negative i overensstemmelse med subepithelial intestinale myofibroblasts. Primære myofibroblastlignende celler kan dyrkes i cellekultur og anvendes til forsøgsformål over et begrænset antal passager.
Introduction
Reguleringen af gastrointestinal (GI) tarmkanalen funktion involverer komplekse og dynamiske samspil mellem slimhinde lag og dens underliggende mesenchyme. Disse interaktioner normalt tjener til at opretholde homøostase, men kan også føre til udvikling af sygdomstilstande under patologiske tilstande 1. Myofibroblasts er en subpopulation af stromaceller placeret underliggende den epithellaget at kommunikere på en parakrin måde med omgivende cellesubpopulationer at regulere en række kritiske mavetarmkanalen processer, der inkluderer mucosal regenerering, reparation og fibrose 2.
Den 18Co cellelinie er et eksempel på en human colon myofibroblastlignende cellelinie, som er blevet bredt anvendt til at undersøge myofibroblastlignende funktion, fordi den deler mange af kendetegnene ved primær in situ myofibroblasts. Heriblandt protein ekspression af a-glat muskulatur actin (α-SMA) og vimentin, såvel som ekspressionen af en rækkeaf celleoverfladereceptorer, såsom den epidermale vækstfaktor receptor eller receptorer for lysophosphatidsyre 3,4. På grund af disse delte ultrastrukturelle karakteristika, samt ligheder i biologisk funktion 5 har 18Co cellelinie vid udstrækning blevet anvendt til at studere myofibroblastlignende funktion i forbindelse med mange sygdomstilstande, såsom inflammatorisk tarmsygdom eller kolorektal cancer 3,6. Der er imidlertid iboende begrænsninger og problemer ved brug af en cellelinie. Disse omfatter genotypisk ustabilitet over tid, der adskiller cellelinier fra primære celler, ændring af fænotype og biologiske funktion af cellen, herunder vækstrater og interaktioner med andre cellepopulationer. Cellelinier også mangle de normale bestanddele af GI mikromiljø (epitelial, stromal og vaskulære komponenter), som er en vigtig begrænsning for dens anvendelse. Derfor konklusionerne fra eksperimentel cellelinje forskning kræver yderligere validering for at reducere risk for fejlfortolkning.
Primære myofibroblasts kan fås fra mennesker og mus tyktarmsvæv at bekræfte eksperimentelle resultater identificeret i en celle linje 7. Metoden blev oprindeligt beskrevet af Mahida et al. 8 og vores protokol er en af mange velbeskrevne teknikker, der kan anvendes til isolering primære myofibroblasts fra muse og human colon 9. For enhver musemodel af colon sygdom, kan denne teknik bruges til at isolere primære myofibroblasts at studere, hvordan de interagerer med de omkringliggende celler eller bidrage til både normal eller patologisk GI processer 10,11. Denne teknik kan anvendes til at undersøge, hvordan myofibroblasts bidrage til mucosale healing, fibrose og udviklingen af colorektale adenomer og karcinomer. Primære myofibroblasts kan også fås fra human colon væv, der er blevet resekteret på tidspunktet for operation for godartede (inflammatorisk tarmsygdom, strikturer, diverticulitis) eller ondartet cETINGELSER. Isolerede primære celler fra mennesker og mus tyktarmsvæv kan dyrkes i cellekultur og anvendt i løbet af et begrænset antal passager.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den generelle teknik er den samme ved brug af enten mus eller human colon. Denne teknik kan også anvendes til at isolere myofibroblasts fra tyndtarmen. Specifikke detaljer til isolering af myofibroblasts fra 1.. mus og 2. human colon er beskrevet nedenfor.
1.. Mus Colon
Vanding af muse colon lettes ved at fastgøre en 4, 16 G Popper stumpendede nålen til den ene ende af tyktarmen. Det hjælper også, når tyktarmen skæring i længderetningen. Du kan harmonika tyk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant 5KO8DK085136-02 til JY.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898 (2011).
