Выделение первичных Миофибробласты из мышиных и человеческих ткань толстой кишки
Summary
Миофибробластов является влиятельным стромальных клеток из желудочно-кишечного тракта, который регулирует важные физиологические процессы в нормальных и болезненных состояний. Опишем метод, который позволяет для выделения первичных миофибробластами с обеих мышиных и человеческих толстой кишки ткани, которая может быть использована для экспериментов в пробирке.
Abstract
Миофибробластов является стромальных клеток из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которая набирает большое внимание своей важной роли в многих функций ЖКТ. В то время как несколько миофибробластов клеточные линии имеются в продаже изучать эти клетки в пробирке, результаты исследований из клеточной линии, подверженных воздействию экспериментальных условиях культуры клеток присущи ограничения из-за чрезмерно редукционистской характера работы. Использование первичных миофибробластов предлагает большое преимущество с точки зрения подтверждения экспериментальные результаты, отмеченные в клеточной линии. Выделение первичных миофибробластами из животной модели позволяет для изучения миофибробластами в условиях, которые более точно имитировать болезненное состояние изучается. Выделение первичных миофибробластов от человеческого ткани двоеточия предоставляет возможно наиболее релевантные экспериментальные данные, так как клетки поступают непосредственно от пациентов с основного заболевания. Мы описываем устоявшихся метод, который можно уtilized изолировать первичные миофибробластов и от мыши и человека толстой кишки ткани. Эти изолированные клетки были охарактеризованы быть альфа-гладких мышц актин и виментин-положительных, и десмин-отрицательных, в соответствии с субэпителиальных кишечных миофибробластов. Первичные элементы миофибробластного могут быть выращены в культуре клеток и использовали для экспериментальных целей более ограниченным числом пассажей.
Introduction
Регулирование желудочно-кишечного (GI) функции тракта включает в себя комплекс, динамические взаимодействия между слоя слизистой оболочки и ее основной мезенхимы. Эти взаимодействия обычно служат для поддержания гомеостаза, но также может привести к развитию болезненных состояний, при патологических состояниях 1. Миофибробласты являются субпопуляции стромальных клеток, расположенных нижележащих к эпителиального слоя, что общаться на паракринного моды с прилегающими клеточные субпопуляции регулировать ряд процессов критических ЖКТ, которые включают слизистой регенерацию, ремонт и фиброз 2.
Клеточная линия 18Co является примером человеческого толстой линии миофибробластов клеток, которая была широко используется для изучения функции миофибробластов, потому что разделяет многие из характеристик первичного на месте миофибробластов. Они включают в себя экспрессию белка а-актин гладких мышц (α-SMA) и виментин, а также экспрессию рядарецепторов клеточной поверхности, таких как рецептор эпидермального фактора роста или рецепторами 3,4 лизофосфатидной кислоты. Из-за этих общих ультраструктурные характеристики, а также сходства в биологической функции 5, линия клеток 18Co широко используется для изучения функции миофибробластов в контексте многих болезненных состояний, таких как воспалительные заболевания кишечника или прямой кишки 3,6 рака. Тем не менее, есть ряд ограничений и проблем при использовании клеточной линии. К ним относятся генотипический нестабильность во времени, что отличает клеточных линий из первичных клеток, изменяя фенотип и биологической функции клетки, в том числе темпы роста и взаимодействия с другими клеточных популяций. Клеточные линии также не имеют нормальных составляющих желудочно-кишечного микроокружения (эпителиальных, стромальных и сосудистых компонентов), который является основным ограничением его использования. Таким образом, выводы из экспериментальных исследований клеточной линии нуждается в дополнительном подтверждении, чтобы уменьшить риSK неправильного толкования.
Первичные миофибробласты может быть получен из человека и мыши толстой кишки ткани, чтобы подтвердить экспериментальные данные, указанные в клеточной линии 7. Способ первоначально был описан Mahida и соавт. 8, и наш протокол является одним из многих хорошо описанных методов, которые могут быть использованы для выделения первичных миофибробластов от мыши и толстой кишке человека 9. Для любого мышиной модели кишечной болезни, этот метод может использоваться, чтобы изолировать первичные миофибробластов изучение того, как они взаимодействуют с соседними клетками или способствовать как нормальный или патологический GI обрабатывает 10,11. Этот метод может быть использован для изучения, как миофибробласты способствовать слизистой исцеление, фиброз и развитие колоректального аденомы и карциномы. Первичные миофибробласты также может быть получен из человеческой толстой кишки тканей, которые были резекции во время операции по поводу доброкачественной (воспалительное заболевание кишечника, стриктуры, дивертикулит) или злокачественной Conditions. Изолированные первичные клетки человека и мыши, толстой кишки ткани могут быть выращены в культуре клеток и использовали в течение ограниченного числа проходов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Общий метод похож, когда, используя либо мышь или толстой кишки человека. Этот метод также может быть использован для изоляции миофибробластов из тонкого кишечника. Конкретные детали для изоляции миофибробластов от 1. мышь и 2. толстой кишки человека, обсуждаются ниже.
1. Мы…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья Грант 5KO8DK085136-02 до JY.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898 (2011).
