Summary

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

Published: October 18, 2013
doi:

Summary

Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l'automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni.

Abstract

La tecnica del patch-clamp è oggi il metodo più consolidata per la registrazione dell'attività elettrica di singoli neuroni o dai loro compartimenti subcellulari. Tuttavia, ottenere registrazioni stabili anche da cellule singole, rimane un tempo procedura di notevole complessità. Automazione di molti passi in congiunzione con display informativo efficiente potranno agevolare sperimentali in esecuzione di un numero maggiore di registrazioni con una maggiore affidabilità e in meno tempo. Per conseguire registrazioni su larga scala abbiamo concluso l'approccio più efficiente non è di automatizzare completamente il processo ma per semplificare le fasi sperimentali e ridurre le possibilità di errore umano mentre efficientemente incorporando esperienza dello sperimentatore e feedback visivo. Con questi obiettivi in ​​mente, abbiamo sviluppato un sistema computerizzato che centralizza tutti i controlli necessari per un esperimento di patch-clamp multi-elettrodo in una singola interfaccia, un commercbuona resa disponibile gamepad wireless, mentre la visualizzazione esperimento correlate di informazione e orientamento spunti sullo schermo del computer. Qui si descrivono le diverse componenti del sistema che ci ha permesso di ridurre il tempo necessario per raggiungere la configurazione di registrazione e sostanzialmente aumentare le possibilità di successo registrando un gran numero di neuroni contemporaneamente.

Introduction

La capacità di registrare e stimolare diversi siti con precisione micrometrica è estremamente utile per sperimentalmente conseguire una migliore comprensione dei sistemi neuronali. Molte tecniche sono stati sviluppati per questo scopo ma nessuno consentire la risoluzione submillivolt realizzato con la tecnica patch-clamp, essenziale per lo studio dell'attività sottosoglia e singoli potenziali postsinaptici. Qui copriamo lo sviluppo di un sistema di patch-clamp dodici elettrodi assistita da computer volto a registrare simultaneamente e stimolare un gran numero di singole cellule con precisione sufficiente per lo studio della connettività neuronale. Mentre molte altre applicazioni possono essere concepite per un tale sistema, si presta particolarmente bene allo studio della connettività sinaptica dato che il numero di possibili connessioni all'interno di un gruppo di neuroni cresce proporzionalmente al quadrato del numero di neuroni in questione. Pertanto, mentre un sistema a tre elettrodi consente di testare l'verificarsi di fino a sei connessioni e più spesso registrando una sola, registrazione dodici neuroni consente di testare la presenza di fino a 132 connessioni e frequentemente osservando oltre un dozzina (Figura 1). L'osservazione di decine di connessioni contemporaneamente rende possibile analizzare l'organizzazione delle piccole reti e dedurre le proprietà statistiche della struttura di rete che non può essere sondato altrimenti 1. Inoltre, la stimolazione precisa di numerose cellule permette anche la quantificazione del reclutamento di cellule postsinaptici 2.

Protocol

1. Preparazione del materiale Manipolatori di comando da un computer Collegare ogni casella di controllo micromanipolatore ad un computer tramite porte seriali (RS-232). Implementare i comandi per il posizionamento, l'interrogazione e la regolazione delle impostazioni da inviare tramite la porta seriale. Problemi di velocità e compatibilità hardware fornite C / C + + è raccomandato come linguaggio di programmazione. Standardizzare il sistema di riferimento …

Representative Results

Seguendo i metodi descritti sopra siamo riusciti a eseguire la registrazione a cellula intera fino a dodici neuroni simultaneamente, quasi raddoppiando il maggior numero di neuroni simultaneamente patch-bloccato finora. Esempi di reti di connessioni sinaptiche diretti tra piramidale neuroni registrati in strato V della corteccia somatosensoriale di ratti sono mostrati in Figura 6. La determinazione dei profili di probabilità connessione in funzione della distanza inter-soma…

Discussion

Una domanda immediata di solito si pone per quanto riguarda il tasso di successo della procedura che abbiamo descritto. Per le alte percentuali di successo preparazione è essenziale. Le pipette devono avere aperture di punta che sono adeguati per le cellule degli esseri registrati. Filtrare la soluzione intracellulare per evitare pipette ostruiti è anche importante. Estremamente pulite, pipette appena tirato sono un altro requisito. Una distribuzione binomiale è il modello più semplice che può essere utilizzato per…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, e Sonia Garcia per preziosi consigli sul miglioramento della procedura di automazione patch-clamp. Ringraziamo Rajnish Ranjan per la consulenza e l'assistenza con l'implementazione software di valore. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal progetto Synapse UE e in parte dal Programma di Scienza Human Frontiers.

Materials

Microscope Olympus BX51WI 40X Immersion Objective
Manipulators Luigs & Neumann SM-5 Serial protocol used
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B SDK used
Camera Till Photonics VS 55 BNC analog output
Framegrabber Data Translation DT3120 SDK used
Oscilloscopes Tektronix TDS 2014 Serial communication
Data acquisition InstruTECH ITC 1600
Data acquisition National Instruments PCI-6221 Library used (.dll)
Pressure valve SMC SMC070C-6BG-32
Pressure sensor Honeywell 24PCDFA6G
Membrane pump Schego Optimal

References

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Cite This Article
Perin, R., Markram, H. A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System. J. Vis. Exp. (80), e50630, doi:10.3791/50630 (2013).

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