이 문서는 거머리를 사용하여 세 가지 신경계 준비 사항 : 세포 내 기록을 복부 신경절에있는 신경 세포에서, 복부 신경절에서 뉴런을 배양하고, 감각 필드를 매핑하는 신경 지배 피부의 패치에서 기록.
민물 거머리, Hirudo medicinalis는, 신경 생리학, neuroethology 및 발달 생물학 분야에서 과학적인 문제를 해결하기 위해 사용 된 다양한 모델 생물이다. 이 보고서의 목적은 다른 신경계 준비에 전문성을 갖춘 생리에 사용이 될 것입니다, 또는 거의없는 전기 생리학 경험 생물학 학생에 하나의 문서에 거머리 시스템의 실험 기술을 통합하는 것입니다. 우리는 신경절에서 확인 된 신경 회로에서 세포 내 기록에 대한 거머리를 해부하는 방법을 보여줍니다. 다음으로 우리는 알려진 기능의 개별 세포가 배양 접시에서 배양하는 신경절, 어떻게 문화에 그 뉴런에서 기록에 제거 할 수있는 방법을 보여줍니다. 그 다음 우리는 감각 모터 필드를 매핑에 사용되는 신경 지배 피부의 패치를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 거머리의 준비는 아직 널리 신경이 networ의 기본적인 전기적 특성을 해결하는 데 사용됩니다KS, 행동, 시냅스, 개발. 또한 신경 생리학 교육 연구소에 대한 적절한 교육 모듈이다.
힐 준비가 식별 (감각, 모터 및 동물의 중추 신경계 (CNS) 내에서 간 신경 세포의 기능을 조사하는 데 유용합니다. 거머리 신경 세포의 유용한 속성은 자신의 활동 전위 및 생물 물리학 적 특성의 모양이 특징적인 점이다 세포 분류 관련 (즉 P, N, T,는 Rz). 더욱이 신경 세포만큼 사십오일 1,2 그들의 전기적 특성을 유지할 수있는 적합한 배지에서 배양 동물로부터 제거 될 수있다.
전기 생리학 녹음을하는 방법을 학습에 대한 거머리 신경절의 뚜렷한 장점은 세포가 특징적으로 안정적으로 할 수있는 패턴의 신경절에 배치되는 것입니다 신경절에서 신경절 및 동물에서 동물로 별개의 세포 유형의 식별. 독특한 위치와 거머리 신경절에있는 신경 세포의 형태는 이미 1891 3 등 Retzius에 의해 관찰되었다. 일에 대한 지식전자 ID 및 신경 세포의 기능은 신경 회로를 조사하는 주어진 세포 유형과 실험을하기에 유리하다. 인해 그들이 해부 현미경으로 볼 수 있으며, 인 somata 선택적 그들의 전기적 특성을 기록하기위한 미소 전극과 찔 수 신경절 뉴런 사이의 비교적 대형 인 somata한다.
염료 및 큰 분자는 각각의 세포 및 패치 클램프에 의해 연구 채널 속성에 주입 할 수있다. 다양한 신경 세포의 특징적인 활동 전위의 다양한 형태로 발생시키는 이온 전류는 4-7 확인되었습니다. 신경 분포의 패턴과 CNS 내의 개별 신경 세포의 분기 조사에서 시냅스 연결이 확인 된 뉴런 2.8와 문화를 재현하고있다. 거머리 신경의 연구도 ë으로뿐만 아니라 전기 생리학으로 측정 할 수있는 기능 회로의 개발에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다전자 동물 행동 연구. 거머리 CNS는 전체 동물의 문화 4-6,9-12에있는 신경 세포의 수리 및 재생과 관련된 메커니즘을 연구하기위한 귀중한 준비를 역임했다.
포유류의 뇌에서는 속성과 개별 식별 뉴런의 연결 측면에서 행동을 설명하는 것은 어려운 작업입니다. 원칙적으로 하나는 거머리 덜 복잡한 시스템의 연구는 고등 동물에 사용되는 기본 메커니즘을 정의하는 데 도움이 될 수 있기를 바랍니다 수 있습니다. 수영 패턴 (13, 14)과 심장 (15)의 리듬의 기초가 사용되는 연결은 잘 거머리 특징으로하고 있습니다. 양쪽 전기 화학 통신을 형성하는 일부 거머리 뉴런의 능력은 흥미 롭다. 다른 사람이 단방향 화학적하지만 양방향 전기적으로 7하는 동안 일부 연결은 양방향이다. 동물 내에서 시냅스 연결을 이해뿐만 아니라 같은 일반을 다시배양 접시에 연결 전자는 시냅스 16-18뿐만 아니라 시냅스 (19)의 약리학 적 프로파일을 조사하기위한 강력한 도구입니다. 여기에 설명 된 세포 내 기록 및 자극 기술은 neuroethology 개발에 약물 분석 및 연구를위한 기초를 제공한다.
또, 분절성 복부 신경 코드는 신경 지배 피부 패치로 해부 될 수있다. 살아있는 피부 패치 및 뉴런을 유지하는 기능, 감각 수용 필드는 CNS에서 각각 복부 신경절 내의 감각 신경의 세포체 (즉 소마)로부터 전기 신호를 기록하여 탐색 할 수있다. 이것 하나는 피부에 힘을 다양한 각도를 적용하여 감각 엔딩의 민감도를 평가하고 수용 필드를 매핑 할 수 있습니다 가벼운 터치, 압력 및 유해 (고통) (20, 21)를 자극.
이 거머리 신경절 피부 준비의 장점은 하나의 캘리포니아N 해부학 적으로 수용 필드 맵을 그리고 전기 응답이 기록되고 일단 확인 된 신경 세포의 연결 과정을 추적. 후술 세 거머리 실험 전체 학술 실험실이 비용 효과적인 교육 모듈을 만드는 하나의 시편, 여러 번으로 완료 될 수있다.
실험이 세트의 목적은 1) 가르치고 전시 세포 내 기록의 기본 원칙을 식별 뉴런과 2) 성인 거머리를 사용하여 이러한 특정 신경 세포 유형에서 발생할 수있는 전기 신호의 특성 모양을 인식하는 것이 었습니다. 이 신경 생리 학적 연구를 위해 거머리를 이용하여 조사의 풍부한 역사는 연구는 신경 회로 및 개발 과정뿐만 아니라 시냅스 수리 및 재생 10시 유전자 조절의 문제를 해결에서 진행되고있다. 신경 조절은 특히 생물 기원 아민의 경로를 통해, 또한 거머리에서 성공적인 연구 방향이었다. 생리 식염수를 통해 신경계의 도파민 및 기타 약물 에이전트를 추가함으로써, 도파민은 의사 결정 문제 (24, 25)를 크롤링 (23)와 모터 패턴에 관련된 신경 네트워크를 변조 것으로 나타났습니다. 이 실험 방법은 바보입니다르 (저렴) 교육 연구소에 변조를 통합 할 수있는 방법, 그리고 식염수의 이온 화장 조정은 네른스트 골드만 지킨 – 카츠 방정식을 가르 칠 수있는 효과적인 방법입니다.
신경절 준비로 성공하기는 신경절 이전 세포 내 전극과 소마를 찌를 시도에 팽팽하게하는 것이 중요합니다. 아교 패킷에 아래로 밀어, 그렇지 않으면 소마 이동합니다. 문화에 신경을 제거하는 신경절을 desheathing 때 제거 될 때 somas가 손상되지 않도록 신경절에 걸쳐 절단 할 때뿐만 아니라, 관심있는 지역을 피하십시오. 또한, 효소의 과도한 배양은 신경 세포를 제거하기에 너무 깨지기 쉬운 존재가 발생할 수 있습니다. 그것은 효소의 각 배치는 자신의 행동에 약간 다르기 때문에 최적의 배양 시간을 달성하기 위해 몇 가지 시행 착오가 필요합니다.
배양 배지를 최적화하기 위해 추가 조사는이 기술을 향상시킬 수 있었다. 바리인슐린, 당, 또는 성장 인자의 존재와 같은 OU에 요인, 문화의 이상 유지 보수를 위해 검사 할 수 있습니다. 세포는는 Rz 세포에서 세로토닌 합성으로 송신기를 합성하는 자신의 능력을 유지하는지 확인하려면, 중립 붉은 얼룩이 세로토닌 프로세스에 라벨을 적용 할 수 있습니다. 부상 및 재생 조직에 또한 미세 아교 침공 부상 후 핵 얼룩 일에 의해 정량화 될 수있다.
이 준비가 재생 및 수리뿐만 아니라 신경 회로를 검사에서 제공하는 많은 혜택을 가지고 있지만, 시냅스의 다양한 수용체 아형의 약물 분자 식별이 완전히 특징되지 않았습니다. 표현 시퀀스 태그 라이브러리는 26 사용할 수 있으며, 의약 거머리의 게놈은 현재 27 조립되고 있지만, 일부 모델 준비에 비해 거머리의 주요 제한은 특정 세포 유형에 선택적 유전자의 게놈을 수정할 수있는 기능입니다. 배아의 t에서그의 제한은 유전자 발현을 조절하는 28 DNA 또는 dsRNA를 주입함으로써 해결되었다. 유전자 총 기술은 최근에 거머리 신경 무척추 넥신 (innexin) 단백질을 표현하기 위해 사용되었다. Hirudo verbana (HVE-inx6)에서 innexin의 식 의약 거머리 29 자궁외 간극 결합의 형성에 충분하다. 의약 거머리 또는 H. 그것은 30이었다로 버베나는 향후 몇 년 동안 생리와 전기 시냅스의 진화에 대한 우리의 이해를 진행해야합니다.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |