Skriva termoresponsiv Omvänd Formar för skapandet av mönstrad Tvåkomponentsemballage Hydrogels för 3D Cell Culture
Summary
En bioprinter användes för att skapa mönstrade hydrogeler baserade på en uppoffrande mögel. Den poloxamer formen återfylldes med en andra hydrogel och eluerades därefter och lämnar hålrum som fylldes med en tredje hydrogel. Denna metod använder snabb eluering och god tryckbarhet poloxamer att generera komplexa arkitekturer från biopolymerer.
Abstract
Bioprinting är en ny teknik som har sitt ursprung i rapid prototyping branschen. De olika tryckmetoder kan delas in i kontakt bioprinting 1-4 (extrudering, dip penna och mjuk litografi), kontaktlös bioprinting 5-7 (laser framåt transfer, bläckstråle-nedfall) och laserbaserade tekniker såsom två photon fotopolymerisation 8. Den kan användas för många applikationer såsom tissue engineering 9-13, Biosensor microfabrication 14-16 och som ett verktyg för att besvara grundläggande biologiska frågor som influenser av samodling av olika celltyper 17. Till skillnad från gemensamma fotolitografiska eller mjuk-litografiskt metoder, har extrudering bioprinting den fördelen att den inte kräver en separat mask eller stämpel. Använda CAD-program, kan utformningen av strukturen snabbt ändras och justeras i enlighet med kraven i operatören. Detta gör bioprinting mer flexibel än litografi-baseradtillvägagångssätt.
Här kan vi visa tryckning av en sacrificial gjutform för att skapa en multi-material 3D struktur med hjälp av en matris av pelare inom en hydrogel som ett exempel. Dessa pelare kan representera hålstrukturerna för en vaskulär nätverk eller rören inom en nerv styrpassagen. Det material som väljs för sacrificial mögel var poloxamer 407, en termoresponsiv polymer med utmärkta tryckegenskaper som är flytande vid 4 ° C och en fast substans över dess gelningstemperatur ~ 20 ° C i 24,5% w / v-lösningar 18. Denna egenskap gör att poloxameren-baserade uppoffrande mögel som eluerades på efterfrågan och har fördelar över den långsamma upplösningen av ett fast material speciellt för trånga geometrier. Poloxamer trycktes på objektglas glas för att skapa den förlorade formen. Agaros pipetterades in i formen och kyldes tills gelning. Efter eluering av poloxamer i iskallt vatten, hålrummen i agaros form fyllts med alginat metakrylat spIKED med FITC-märkt fibrinogen. De fyllda hålrum därefter tvärbands med UV och konstruktet avbildades med ett epi-fluorescensmikroskop.
Introduction
Tissue engineering metoder har gjort stora framsteg under de senaste åren när det gäller förnyelse av mänskliga vävnader och organ 19,20. Men fram tills nu, har fokus för tissue engineering har ofta begränsat till vävnader som har en enkel struktur eller små dimensioner såsom urinblåsa 21,22 eller huden 23-25. Den mänskliga kroppen innehåller dock många komplexa tredimensionella vävnader där celler och extracellulär matris är anordnade i ett spatialt definierat sätt. För att tillverka dessa vävnader, är en teknik som krävs som kan placera celler och extracellulär matris ställningar inom en tredimensionell konstruktion vid specificerade positioner. Bioprinting har potential att bli en sådan teknik där visionen för tillverkning av komplexa tredimensionella vävnader kan förverkligas 10,11,26-28.
Bioprinting definieras som "användning av processer material överförs till mönstring och montering biologiskt relvanta material – molekyler, celler, vävnader och biologiskt nedbrytbara biomaterial -. med en föreskriven organisation för att uppnå ett eller flera biologiska funktioner "4 Den omfattar flera olika tekniker som arbetar vid olika upplösningar och skalor längd, allt från den sub-micron upplösning av två -photon polymerisation 29 till en upplösning på 150 nm till 420 nm för extrudering utskrift 1,12,30. Inte ett enda material eller material kombination kommer att uppfylla kraven i varje metod 31. För extrudering utskrift, de viktigaste parametrarna är viskositet och gelningstiden 32, där hög viskositet och snabb gelning är önskvärda.
3D-utskrift är en teknik som gör det enkelt att skapa uppoffrande formar för att skapa komplexa geometrier 30,33,34. Denna process är baserad på konstruktionen av en form med användning en rapid prototyping teknik såsom en strängsprutning bioprinter. Den skapade sacrificial form användsatt bilda komplexa strukturer från material som är svåra att skriva ut på grund av sin låga viskositet och långsam gelningstid. Den metod som presenteras här innebär skapandet av en sacrificial form bestående av ett material som löser sig snabbt vid låg temperatur och kan extruderas exakt. Segmentsampolymeren poly (etylenglykol) 99-poly (propylenglykol) 67-poly (etylenglykol) 99 (även känd som Pluronic F127 eller poloxamer 407) uppfyller dessa krav. Det har redan använts i en modifierad version av extrudering utskrift 1 men, till vår kunskap, har aldrig använts för utskrift i dess omodifierade versionen på grund av dess instabilitet i flytande miljöer. Poloxamer 407 visar också ett omvänt termiskt lyhörd beteende 18, dvs den förändras från en gel till en sol vid kylning. Viktigast av allt, kan den tryckas in i komplexa godtyckligt krökta strukturer med mycket hög trohet. Detta möjliggör skapandet av en strukturerad hydrogel från enlåg viskositet material, i detta fall långsam gelbildande agaros, genom att pipettera lösningen i tryckta uppoffrande mögel. Kombinationen av att skriva ut uppoffrande formen med hifi och dess snabba eluering från gjutna strukturerade hydrogel gör det en snabb och flexibel metod för att skapa formar med olika geometrier utan användning av en mask eller en stämpel som det ofta krävs i litografiska metoder. Den gjutna strukturerade hydrogelen kan vidare fyllas med ett annat material som inte är lämplig för strängsprutning utskrift beroende på dess låga viskositet. Detta är i vårt fall ett lågvisköst alginat metakrylat lösning. Här presenterar vi den metod för termoresponsiv omvänd uppoffrande formar för hydrogel mönstring med hjälp av exempel på en pelare array.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi, för första gången, användning av en termoresponsiv polymer för en sacrificial mold som snabbt kan elueras i kallt vatten på grund av gel-sol övergång av poloxamer på ~ 20 ° C. Hastigheten av hela processen gör poloxamer intressant för att snabbt skapa biopolymera strukturer som inte kan skrivas ut med tillräcklig upplösning. Den teknik som beskrivs här kan användas för mönstring en hydrogel i en annan hydrogel eller för skapandet av mikroflödessystem kanaler som tidigare har rapp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Deborah Studer för hjälpen med bioprinter.
Arbetet har finansierats av Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr NMP4-SL-2009 till 229.292.
Materials
| REAGENTS | |||
| Poloxamer (Pluronic F127) | Sigma | P2443 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-015 | |
| CAD software | regenHU | BioCAD | |
| Alginate methacrylate | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | F13191 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| EQUIPMENT | |||
| Bioprinter | regenHU | Biofactory | |
| Valve | regenHU | 300 μm Nozzel Diameter | |
| Needle | regenHU | 150 μm Inner Diameter | |
| Zeiss Axioobserver with ApoTome | Zeiss | ||
| UV Light Source | UVP | Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp | 100 W |
References
- Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
- Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
- Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
- Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
- Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
- Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
- Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
- Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
- Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).
- Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. , 82-85 (2009).
- Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
- Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
- Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin’oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
- Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
- Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
- Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering–in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
- Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
- Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
- He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
- Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
- Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
- Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
- Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).
- Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
- Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
- D’Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
- Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
- Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).
