Skrive Thermoresponsive Omvendt Former for skapelsen av Mønstret To-komponent Hydrogeler for 3D Cell Culture
Summary
En bioprinter ble brukt til å lage mønstrede hydrogeler basert på en oppofrende mold. Poloksameren Formen ble tilbakefylt med en andre hydrogel og deretter eluert, og etterlater hulrom som var fylt med en tredje hydrogel. Denne metoden bruker raske eluering og god trykkbarhet poloxamer å generere komplekse arkitekturer fra biopolymerer.
Abstract
Bioprinting er en ny teknologi som har sin opprinnelse i det rapid prototyping bransjen. De ulike utskrift prosesser kan deles i kontakt bioprinting 1-4 (pressbolt, dip penn og myk litografi), kontaktløs bioprinting 5-7 (laser fremover overføring, ink-jet avsetning) og laser baserte teknikker som to foton fotopolymerisasjon åtte. Den kan brukes til mange applikasjoner som tissue engineering 9-13, biosensor microfabrication 14-16 og som et verktøy for å svare på grunnleggende biologiske spørsmål som påvirkninger av co-dyrking av ulike celletyper 17. I motsetning til vanlige fotolitografiske eller soft-litografiske metoder, har ekstrudering bioprinting den fordelen at den ikke krever en egen maske eller stempel. Ved hjelp av CAD-programvare, kan utformingen av strukturen raskt endres og justeres i henhold til kravene i føreren. Dette gjør bioprinting mer fleksibel enn litografi-baserttilnærminger.
Her kan vi demonstrere utskrift av en oppofrende mugg å lage en multi-materiale 3D-struktur ved hjelp av en rekke pilarer innenfor en hydrogel som et eksempel. Disse pilarene kunne representere hule strukturer for en vaskulær nettverk eller rørene i en nerve guide kanal. Materialet valgt for offer-formen var 407 poloksamer, et thermoresponsive polymer med gode-egenskaper som er flytende ved 4 ° C og en fast over sin gelatineringstemperatur ~ 20 ° C i 24,5% w / v 18 løsninger. Denne egenskapen gjør det mulig for poloksamer-baserte offer-mugg kan elueres etter behov og har fordeler fremfor den langsomme oppløsning av et fast materiale, spesielt for smale geometrier. Poloxamer ble trykt på mikroskop glassplater å skape den oppofrende mold. Agarose ble pipetteres i formen og avkjølt før gelation. Etter eluering av poloksamer i iskaldt vann, ble hulrommene i den på agarose formen fylt med alginat-metakrylat spiked med FITC merket fibrinogen. De fylte hulrom ble deretter kryssbundet med UV og konstruere ble fotografert med en epi-fluorescens mikroskop.
Introduction
Tissue engineering tilnærminger har gjort mye fremgang over de siste årene med hensyn til regenerering av menneskelig vev og organer 19,20. Men inntil nå, har fokuset i tissue engineering vært ofte begrenset til vev som har en enkel struktur eller små dimensjoner som blæren 21,22 eller huden 23-25. Menneskekroppen inneholder imidlertid mange komplekse tredimensjonale vev hvor celler og ekstracellulær matriks er anordnet i en romlig definert måte. For fremstilling av disse vev, er en teknikk som kreves som kan plassere celler og ekstracellulær matriks stillas innenfor en tredimensjonal konstruksjon ved angitte posisjoner. Bioprinting har potensial til å være en slik teknikk der visjonen om produksjon komplekse tredimensjonale vev kan realiseres 10,11,26-28.
Bioprinting er definert som "bruk av materiale overføre prosesser for mønster og montering biologisk relvante materialer – molekyler, celler, vev og biologisk nedbrytbare biomaterialer -. med en foreskrevet organisasjon til å gjennomføre én eller flere biologiske funksjoner "4 Den omfatter flere forskjellige teknikker som fungerer på forskjellige oppløsninger og lengde skalaer, alt fra det sub-micron oppløsning på to -foton polymerisasjon 29 til en oppløsning på 150 mikrometer til 420 mikrometer for ekstrudering utskrift 1,12,30. Ikke en eneste materiale eller kombinasjonen vil tilfredsstille kravene til hver metode 31. For ekstrudering utskrift, de viktigste parametrene er viskositet og gelation tid 32, der høy viskositet og rask gelation er ønskelig.
3D-utskrift er en teknikk som gjør det mulig enkelt å lage offerplasser former for å lage komplekse geometrier 30,33,34. Denne prosessen er basert på konstruksjonen av en form ved hjelp av en hurtig prototyper teknikk slik som en ekstrudering bioprinter. Den opprettede oppofrende mold brukesfor å danne komplekse strukturer fra materialer som er vanskelige å skrive ut på grunn av deres lave viskositet og langsom gelering tid. Metoden som presenteres her, må det opprettes en offer-formen som består av et materiale som oppløses raskt ved lav temperatur og kan ekstruderes nøyaktig. Den blokk-kopolymer av poly (etylenglykol)-99-poly (propylenglykol) 67-poly (etylenglykol) 99 (også kjent som Pluronic F127 eller poloksamer 407) fyller disse krav. Det har allerede blitt brukt i en modifisert versjon i ekstrudering utskrift 1, men til vår kunnskap, har aldri vært brukt for utskrift i sin umodifiserte versjonen på grunn av sin ustabilitet i flytende miljøer. Poloxamer 407 viser også en invers termisk responsive atferd 18 dvs. den endres fra en gel til en sol ved avkjøling. Viktigst, kan det bli skrevet inn i komplekse vilkårlig buede strukturer med svært høy nøyaktighet. Dette tillater etablering av et strukturert hydrogel fra enlav viskositet, og i dette tilfelle langsom geldannende agarose, ved å pipettere løsningen i den trykte offer-mugg. Kombinasjonen av å trykke den offer-formen med høy nøyaktighet og dens raske eluering fra den støpte strukturert hydrogel gjør det til en rask og fleksibel metode for å lage støpeformer med forskjellige geometrier uten bruk av en maske eller et stempel som det ofte kreves i litografiske metoder. Den støpte strukturert hydrogel kan videre fylt med et annet materiale som ikke er egnet for ekstrudering trykking på grunn av sin lave viskositet. Dette er i vårt tilfelle en lav viskositet alginat methacrylate løsning. Her presenterer vi metoden for thermoresponsive omvendt offerplasser støpeformer for hydrogel mønster ved hjelp av eksempel på en søyle array.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer, for første gang, ved bruk av en thermoresponsive polymer for en offer-mugg som raskt kan elueres i kaldt vann på grunn av gel-sol overgang av poloksamer på ~ 20 ° C. Hastigheten på hele prosessen gjør poloksameren interessant for den raske etableringen av biopolymer strukturer som ikke kan skrives ut med tilstrekkelig oppløsning. Teknikken er beskrevet her kan brukes til mønster en hydrogel innen en annen hydrogel eller for etablering av microfluidic kanaler som tidligere er rapportert for andre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Deborah Studer for hjelp med bioprinter.
Arbeidet ble finansiert av EU Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) i henhold til stipend avtale n ° NMP4-SL-2009-229292.
Materials
| REAGENTS | |||
| Poloxamer (Pluronic F127) | Sigma | P2443 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-015 | |
| CAD software | regenHU | BioCAD | |
| Alginate methacrylate | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | F13191 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| EQUIPMENT | |||
| Bioprinter | regenHU | Biofactory | |
| Valve | regenHU | 300 μm Nozzel Diameter | |
| Needle | regenHU | 150 μm Inner Diameter | |
| Zeiss Axioobserver with ApoTome | Zeiss | ||
| UV Light Source | UVP | Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp | 100 W |
References
- Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
- Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
- Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
- Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
- Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
- Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
- Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
- Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
- Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).
- Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. , 82-85 (2009).
- Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
- Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
- Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin’oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
- Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
- Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
- Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering–in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
- Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
- Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
- He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
- Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
- Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
- Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
- Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).
- Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
- Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
- D’Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
- Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
- Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).
